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吸光光度分析方法,又名紫外及可见分光光度法(UV-Vis),是依据物质分子对紫外及可见光谱区的吸收特性和吸收程度,进行定性和定量分析的一种吸收光谱法。
全自动生化分析仪用于检验血液中各物质含量,便是吸光光度分析方法的应用之一。分析过程中,通过显色反应,利用不同的生化试剂将不同物质的含量以颜色深浅的形式反映出来,再借助郎伯-比尔定律进行定量分析。
1729年,布格阐明了辐射强度与吸收层厚度之间的关系,随后,1760年郎伯对此进行了阐述。1852年,比尔提出了辐射强度与吸收物浓度之间的相似关系,从而形成了著名的布格-郎伯-比尔定律。该定律的数学表达式为:A= = bc(式中,A为吸光度,I0为入射辐射强度,It为透过辐射强度,b为吸收层厚度(cm),C为吸收物的摩尔浓度(M),ε为摩尔吸光系数(L﹒mol﹒cm))。
比尔定律广泛应用于紫外-可见-红外光谱区吸收测量,全自动生化分析仪中的各项生化指标检验均基于此定律。
比尔定律的成立需满足以下条件:入射辐射为单色辐射;吸收过程中各物质无相互作用,但各物质的吸光度具有加合性;辐射与物质的作用仅限于吸收过程,无荧光、散射和光化学现象;吸收物为均匀分布的连续体系。
若偏离上述任何一点,吸光度与浓度(或吸收层厚度)的线性关系将受到影响,从而影响分析结果的准确性。其中,条件(2)和(3)由生化分析试剂的特性来保证,(1)由光学系统来保证,(4)由搅拌机构来保证。