不用微流控,怎样提高高通量测序单细胞基因组的成功率
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发布时间：2022-04-24 00:36
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时间：2023-10-15 19:55
Tn5是一种转座酶，可以将DN*段插入到基因组中，因此可以利用Tn5，将想要的序列插入到基因组，并且可以将基因组打断成相应的片段，并且在末端链接上想要的序列，如果我们在末端链接的序列上，使用不同的序列，因此便可以进行复杂的组合建库。
那什么叫复杂建库那？
复杂建库的方法就是将PCR index引入的时候，和Tn5 index引入的时候，进行组合，从而最终可以形成数十万种不同的index，而每一个细胞将会得到唯一的index，这也就是复杂建库的精髓所在。
那么如何将复杂建库应用在单细胞测序上哪？
其实两年前，便有科学家们着手这方面的研究，通讯作者Jay也就是本期单细胞HiC的通讯作者。
上图也就是复杂建库方法的精髓所在，首先将细胞用FACS分选到96孔板中，让每个孔有25个左右的细胞，然后不同孔之间使用不同的Tn5对应的index，进行插入整合。这个时候，每个孔内细胞的index是一样的，而且细胞是完整的。
然后再对细胞进行混合和重新分配，然后这样，在新的96孔板里面，每个细胞的index是不一样的，然后对每一个孔，裂解，加上PCR对应的index，这样就保证了每个细胞的index的唯一性。
理解了这种index的复杂建库方法进行单细胞测序后，Jay在2014年这篇Science中开展的就是ATAC-seq，事实上，转座酶对染色体的插入并非均一的，而是插入在活性区域，这样便可以进行活性区域的判断。
然而，如果是想要单细胞DNA测序的话，这个便成了劣势，显然，如果有些区域无法插入，进而就无法建库，那么无法进行DNA覆盖。
因此科学家们构思了一个非常巧妙的方法，第一种方案是通过锂辅助的核小体去除的方法，第二种是通过SDS然后欧联的方法。
通过这两种方法，可以看到在上图中，仍然保持细胞核的完整性。
然后用复杂建库的方法，进行测序，这个时候就可以获得更加平均插入的Tn5，index。
从这张图可以看到与标准的进行比对，LAND和xSDS两种方法，可以具有更加均衡的插入建库。
既然获得了这种方法，下面需要做的便是评价方法的适用情况，是否可以进行有效的基因组建库？与其他方法相比如何？
首先科学家们对测序的序列，进行分析，可以看到所有的细胞中，明显的分为两类，一类是具有重复序列很少，质量比较高，一类重复序列很多。显然前者更适合用于最终的数据分析。
那么是否真的是单细胞分析那？
科学家们将小鼠和人的细胞进行混合，这样，如果最终测到的细胞有小鼠和人细胞混合的reads，那么提示并非真正的单细胞。不过这一类数据很少，提示确实是单细胞数据。
那么测序数据的覆盖度如何那？
MAD和MAPD可以用于评价不同测序方法覆盖度的水平，分数越低越好，可以看到在两种评价标准中LAND都比xSDS差。
SCI-seq最显著的应用便是用于基因组拷贝数情况的分析：
首先针对于不同核型的细胞，科学家们对不同的方法进行分析：
可以看到过滤后的数据而言，xSDS已经和DOP和QRP相差无几。
最终科学家们将这种方法，应用于恒河猴的大脑染色体拷贝数分析，和癌症单细胞拷贝数分析：
可以预见在不远的将来单细胞测序的费用越来越低，将成为人们解析更高层次的生命活动的基本手段。
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时间：2023-10-15 19:55
Tn5是一种转座酶，可以将DN*段插入到基因组中，因此可以利用Tn5，将想要的序列插入到基因组，并且可以将基因组打断成相应的片段，并且在末端链接上想要的序列，如果我们在末端链接的序列上，使用不同的序列，因此便可以进行复杂的组合建库。
那什么叫复杂建库那？
复杂建库的方法就是将PCR index引入的时候，和Tn5 index引入的时候，进行组合，从而最终可以形成数十万种不同的index，而每一个细胞将会得到唯一的index，这也就是复杂建库的精髓所在。
那么如何将复杂建库应用在单细胞测序上哪？
其实两年前，便有科学家们着手这方面的研究，通讯作者Jay也就是本期单细胞HiC的通讯作者。
上图也就是复杂建库方法的精髓所在，首先将细胞用FACS分选到96孔板中，让每个孔有25个左右的细胞，然后不同孔之间使用不同的Tn5对应的index，进行插入整合。这个时候，每个孔内细胞的index是一样的，而且细胞是完整的。
然后再对细胞进行混合和重新分配，然后这样，在新的96孔板里面，每个细胞的index是不一样的，然后对每一个孔，裂解，加上PCR对应的index，这样就保证了每个细胞的index的唯一性。
理解了这种index的复杂建库方法进行单细胞测序后，Jay在2014年这篇Science中开展的就是ATAC-seq，事实上，转座酶对染色体的插入并非均一的，而是插入在活性区域，这样便可以进行活性区域的判断。
然而，如果是想要单细胞DNA测序的话，这个便成了劣势，显然，如果有些区域无法插入，进而就无法建库，那么无法进行DNA覆盖。
因此科学家们构思了一个非常巧妙的方法，第一种方案是通过锂辅助的核小体去除的方法，第二种是通过SDS然后欧联的方法。
通过这两种方法，可以看到在上图中，仍然保持细胞核的完整性。
然后用复杂建库的方法，进行测序，这个时候就可以获得更加平均插入的Tn5，index。
从这张图可以看到与标准的进行比对，LAND和xSDS两种方法，可以具有更加均衡的插入建库。
既然获得了这种方法，下面需要做的便是评价方法的适用情况，是否可以进行有效的基因组建库？与其他方法相比如何？
首先科学家们对测序的序列，进行分析，可以看到所有的细胞中，明显的分为两类，一类是具有重复序列很少，质量比较高，一类重复序列很多。显然前者更适合用于最终的数据分析。
那么是否真的是单细胞分析那？
科学家们将小鼠和人的细胞进行混合，这样，如果最终测到的细胞有小鼠和人细胞混合的reads，那么提示并非真正的单细胞。不过这一类数据很少，提示确实是单细胞数据。
那么测序数据的覆盖度如何那？
MAD和MAPD可以用于评价不同测序方法覆盖度的水平，分数越低越好，可以看到在两种评价标准中LAND都比xSDS差。
SCI-seq最显著的应用便是用于基因组拷贝数情况的分析：
首先针对于不同核型的细胞，科学家们对不同的方法进行分析：
可以看到过滤后的数据而言，xSDS已经和DOP和QRP相差无几。
最终科学家们将这种方法，应用于恒河猴的大脑染色体拷贝数分析，和癌症单细胞拷贝数分析：
可以预见在不远的将来单细胞测序的费用越来越低，将成为人们解析更高层次的生命活动的基本手段。
