实时PCR探针熔解曲线技术在检查耐多药结核的临床应用价值探讨

实时PCR探针熔解曲线技术在检查耐多药结核的临床应用价值探讨

摘要】目的研究实时PCR探针熔解曲线技术在检查耐多药结核的临床应用方法，并与传统的结核菌培养及药敏试验作对比分析，从而得出其应用价值评价。方法回顾性分析我科2012年1月至2016年4月收治的50例耐多药结核病人的药敏检查结果。51例病人均做了实时PCR探针熔解曲线技术的药敏试验，其中11例病人还同时作了传统的结核菌培养及药敏试验。以结核菌培养及药敏试验作为金标准，并对两种检查方法作对比分析，得出其应用价值评价。结果耐INH、RFP、EMB、SM、OFX共12例，耐INH、RFP共21例，耐INH、RFP、EMB共15例、单耐INH者2例，单耐RFP者1例。11例作两种检测方法的药敏结果符合率为97.22%。结论 实时PCR探针熔解曲线技术可快速、灵敏、特异检测结核耐药。

【关键词】结核杆菌；耐药；PCR；探针熔解曲线技术

Real time PCR probe melting technology in multi drug resistant tuberculosis in the clinical value of examination

IANG Tai, YANG Ren-hui

The Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University in Guizhou Province, Tuyun City: 558004

[Abstract]ObjectiveTo study real-time PCR probe melting curves in check resistant multi drug tuberculosis clinical application method, and the results were compared with the traditional bacterial culture and drug sensitivity test, then draws

a conclusion that the application of value evaluation.Methodsthe results of drug sensitivity test in 50 patients with multi drug resistant tuberculosis were retrospectively analyzed in our department from January 2012 to April 2016. 51 patients per capita do the drug sensitivity test of real-time PCR probe melting curves, which 11 patients also for the traditional bacterial culture and drug sensitivity test. To bacterial culture and drug sensitive test was used as the gold standard and on the two kinds of inspection methods as comparative analysis, it is concluded that the application of value evaluation. Resultsresistant to INH, RFP, EMB, SM, OFX a total of 12 cases, 21 cases of INH, RFP,, INH, RFP, EMB a total of 15 cases, 2 cases of single INH, 1 cases of single resistant RFP cases. The results of drug sensitivity test of 11 cases were 97.22% and two. Conclusionreal time PCR probe melting curve technology is fast, sensitive and specific detection of drug resistant tuberculosis.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis; drug resistance; PCR; probe melting technology

【中图分类号】R473 【文献标识码】A 【文章编号】2096-0867（2016）08-145-02

2010年全世界新发肺结核880万，每年死亡约300万人；我国结核病发病人数约130万，每年约死亡25万人。占全球发病的14.3%，位居全球第2位，是全球结核病流行严重的国家之一，同时也是全球耐药结核病流行严重的国家之一。耐药结核病流行现状：全国活动性肺结核患者总耐多药率为8.32%，其中初治肺结核总耐药率为5.71%，复治肺结核总耐药率为25.64%，总广泛耐药率为0.68%，其中初治肺结核为0.47%，复治肺结

核为2.06%，据此估计，我国每年新发耐多药肺结核患者约12万例，其中广泛耐药肺结核患者约1万例。《全国结核病防治规划（2011-2015）》指出“近年来，我国每年报告肺结核新发病人数约100万，始终位居全国甲乙类传染病的前列，多耐药肺结核危害日益凸显，每年新发患者人数约12万，未来数年内可能出现以耐药菌为主的结核流行态势[1]。由于结核菌生长缓慢，传统药敏通常需耗时6-8周，所以对耐药结核的快速诊断是制定有效抗痨方案和防止耐药菌传播的关键。我科采用实时PCR探针熔解曲线技术检查耐多药结核，并与传统的结核菌培养及药敏试验作对比，从而得出其临床应用价值评价。

1对象与方法

一、对象 选择我科2012年1月至2016年4月收治的50例耐多药结核病人的药敏检查结果。50例病人均做了实时PCR探针熔解曲线技术的药敏试验，其中11例病人还同时作了传统的结核菌培养及药敏试验。

二、检测方法实时PCR探针熔解曲线分析技术是最近发展起来的一种分子检测技术，该技术基于聚合酶链式反应（PCR）和荧光PCR熔解曲线分析技术，通过PCR扩增产物和两端标记的探针的杂交和熔解曲线分析，得到杂交产物的熔点值（Tm值），如果靶序列与探针完全匹配，则探针与该序列杂交的Tm值最高；如果探针与序列不完全匹配则探针与该序列杂交的Tm值低于探针与完全匹配序列杂交的Tm值。Tm值的差异分析可实现对结核分枝杆菌耐药突变的快速检测[3]。

2结 果

一、51例耐INH、RFP、EMB、SM、OFX共12例，耐INH、RFP共21例，耐INH、RFP、EMB共15例、单耐INH者2例，单耐RFP者1例。

二、11例同时做实时PCR探针熔解曲线技术的药敏试验和传统的结核菌培养及药敏试验结果如下。

3讨论

目前我国耐多药型肺结核主要依靠传统的罗氏培养基分离培养药敏试验进行诊断，而该实验非常耗费时日，通常需要6—8周，达不到临床医师快速准确诊断要求。而实时PCR探针熔解曲线分析技术是最近发展起来的一种分子检测技术该技术基于聚合酶链式反应（PCR）和荧光PCR熔解曲线分析技术，通过PCR扩增产物和两端标记的探针的杂交和熔解曲线分析，得到杂交产物的熔点值（Tm值），如果靶序列与探针完全匹配，则探针与该序列杂交的Tm值最高；如果探针与序列不完全匹配则探针与该序列杂交的Tm值低于探针与完全匹配序列杂交的Tm值。Tm值的差异分析可实现对结核分枝杆菌耐药突变的快速检测。目前，基于该技术已经开发出一系列结核耐药突变检测试剂，包括利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉

素、氟喹诺酮和注射类二线药等检测试剂，并在临床实践研究中获得了好评[3,4]。本研究对实时PCR探针熔解曲线技术进行临床观察，证实该方法实为一种高效、快速、准确的检测方法，其用时仅需一天，其检验结果与传统药敏试验结果符合率达97.22%，与李辉等报告的符合率96.88%吻合[5]，值得临床应用推广。

参考文献

[1] Word Health organization.Global tuberculosis report 2012[R].Geneva:

WHO,2012.

[2] Huang QY, et al., Multiplex Fluorescence Melting Curve Analysis fort Mutation Detection with Dual-Labeled, Self- Quenched Probes. Plos one. 2011. 6(4):1-9.

[3] 牛建军，张轶，等. 应用探针熔解曲线分析法检测结核分枝杆菌rpoB基因突变[J]. 中华预防医学杂志，2011 45（3）：225-229.

[4] 马艳艳，李辉，等. 荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究. 中国国境卫生检疫杂志[J]，2011,34（6）：451-456.

[5] 李辉，王少华等.2种结核分枝杆菌耐多药基因检测方法诊断耐多药结核病的评估研究[J].中国卫生检验杂志，2015，25(15):2567-2569.