有效磷的测定方法

有效磷的测定方法

方法1、钼锑抗比色法

解磷菌发酵菌液（用什么培养基？？）经离心处理后，取上清液，用2，4．二硝基酚作为指示剂加入1．2滴，上清液中可溶性磷酸盐可与钼锑抗显色剂反应，生成磷钼蓝，于适宜波长处进行比色测定，根据标准曲线计算出有效磷的含量，通过有效磷的浓度大小表示微生物溶磷能力的高低。

1、实验所用溶液

(1)钼锑抗贮存液的制备

首先量取硫酸153ml(p=约1.84g/ml)缓缓地倾入约400ml蒸馏水中，搅拌、冷却。然后称取lO.0g钼酸铵溶于约60℃的300m1水中，冷却。然后将上述硫酸溶液缓缓加入此钼酸铵溶液中，再加入5g/L酒石酸锑钾溶液100ml，最后用水稀释至l L，盛于棕色瓶中，放于阴暗处保存。

(2)钼锑抗显色剂

准确称量抗坏血酸1.5g，溶于lOOml钼锑抗贮存液中。此溶液必须现配现用，有效期为1d.

(3)磷标准溶液(5 mg/L)

准备称取0.439g磷酸二氢钾在105℃烘箱中烘干2 h后冷却，溶于200 ml水中，加人5 m1硫酸(p约1．84g/ml)，转入l L容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，即为磷标准液100mg/L。

取此溶液准确稀释20倍即为5 mg/L磷标准溶液，此溶液不宜久放。

2、工作曲线的绘制

分别吸取5mg/L磷标准溶液0、2、4、6、8、10、12ml于50m1容量瓶中，加水稀释大约至20m1，加入5ml钼锑抗显色剂，摇匀后定容，即得0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/L磷标准系列溶液，在室温20℃-25℃下放置4 h后，以0 mg/L磷标准液为对照溶液，其余磷标准溶液与待测液同时比色，并记录在该峰值下的吸光度。以测得的吸光度为纵坐标，磷浓度(mgL)为横坐标，绘制成工作曲线。

3、菌液的制备

在300 ml三角瓶中分别加入50 m1培养基，121℃灭菌20 min。无菌操作，每瓶接入已经活化的待测菌种，不接种菌种的作为空白对照，置于30℃摇床上，160 r／min振荡培养5 d~7 d后，取出测定有效磷含量。

4、样品的测试

发酵液在4000 r／min的条件下离心30 min，吸取上清液，用蒸馏水稀释适当倍数后，量取若干毫升加入50 ml容量瓶中，滴加2．3滴2，4-二硝基酚指示剂溶液，用1 mol/L氢氧化钠溶液或硫酸溶液调节pH至溶液刚呈现微黄色(小心缓加，边加边摇)，然后加入钼锑

抗显色剂5m1摇匀，定容至刻度。空白试验发酵液做相同的处理，在室温20．25℃下放置4 h左右，在721分光光度计上660 nm处比色，测定吸光度，以空白试验发酵液为对照液调零点，读取吸光度值，在工作曲线上查出磷标准液的浓度。

方法2 磷钼蓝比色法

(1)磷钼蓝比色法原理

在含磷的溶液中，加入钼酸铵，在一定酸度条件下，溶液中的磷酸与钼酸络合形成黄色的磷钼杂合酸一磷钼黄。H3P04+12H2M004=H3[PMol2040]+12H20

在适宜的试剂浓度下，加入适当的还原剂(sncl2或抗坏血酸)，使磷钼酸中的一部分M06+还原为Mo5+，生成磷钼蓝(磷钼杂多蓝)一H3P04·10Mn03·M0205或H3P04·8Mn03·2Mn205。在一定的范围内，蓝色的深度与磷含量成形比，这是钼蓝比色法的基础。用可见分光光度计在波长660nm处测定钼蓝的吸光值，以定量分析磷含量。

(2)绘制OD660一磷含量标准曲线：

准确吸取磷标准使用液O、0.2、O.4、O．6、O．8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL(相当于含磷O、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20υg)分别置于10mL具塞试管中，加入钼蓝比色混合液5mL，加水至刻度、混匀，于45℃水浴25min后，以O号管作空白，使用可见分光光度计在660nm波长处测定吸光度，以测出的吸光度对磷含量绘制磷标准曲线。

(3)培养液中可溶性磷含量的测定

接菌后分别在24、48、72、96、120小时取样，将培养液4500r／min离心15min，准确吸取5mL上清液置于10mL具塞试管中，加入5mL比色混合液，于45℃水浴25min，使用紫外分光光度计在660nm波长处测定吸光度，利用OD660磷含量标准曲线计算培养液中的磷含量。解有机磷的测定则是在上清液中加入过硫酸钾溶液，120℃下反应30min，然后重复以上过程。