(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104651274 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.05.27
(21)申请号 201510045714.9(22)申请日 2015.01.29
(71)申请人湖南农业大学
地址410128 湖南省长沙市芙蓉区湖南农业
大学(72)发明人周辉 蒋立文 周红丽 田云(74)专利代理机构长沙正奇专利事务所有限责
任公司 43113
代理人马强 周栋(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)C12R 1/125(2006.01)C12R 1/10(2006.01)C12R 1/07(2006.01)
权利要求书1页 说明书3页
(54)发明名称
一种高密度培养芽孢杆菌的方法(57)摘要
本发明公开了一种高密度培养芽孢杆菌的方法。所述方法是以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌等芽孢杆菌中的一种为发酵菌种，经活化以后接种到发酵培养基中进行培养。与现有技术相比，本发明是利用食品豆制品加工中产生的黄浆水作为培养基原料，添加一定量的碳源、氮源和无机盐，来进行芽孢杆菌的高密度培养，不仅提高了工业发酵过程中芽孢杆菌的活菌数，同时有效降低了芽孢杆菌高密度培养的成本，芽孢杆菌的细胞生物量可以达到1010个/mL以上，比目前报道的培养结果高出一到两个数量级，提高了近百倍。 C N 1 0 4 6 5 1 2 7 4 A CN 104651274 A
权 利 要 求 书
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1.一种高密度培养芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
将保存的芽孢杆菌接种至活化培养基中，于30～42℃，转速100～250 rpm的条件下培养20～24 h，得活化后的芽孢杆菌；所述活化培养基由以下重量百分比的组分组成：可溶性淀粉0.5～1.5%、多价胨0～1.0%、氯化钠0～0.5%、磷酸二氢钾0～0.3%、磷酸氢二钾0～0.3%，其余为黄浆水；
将活化后的芽孢杆菌按1～5%接种量接种至发酵培养基，于30～42℃，转速100～250 rpm的条件下培养20～36 h；所述发酵培养基由以下重量百分比的组分组成：可溶性淀粉0.5～1.5%、多价胨或牛肉膏0～1.0%、氯化钠0～0.5%、磷酸二氢钾0～0.3%、磷酸氢二钾0～0.3%，硫酸镁0.05～0.15%、碳酸钙0.005～0.015%，硫酸锰0.05～0.15%，其余为黄浆水。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌或淀粉液化芽孢杆菌。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化培养基和发酵培养基中的黄浆水是将新鲜黄浆水离心后的上清液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述离心时的转速为5000～8000 rpm。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH值为6.0～8.0。6.一种芽孢杆菌发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基由以下重量百分比的组分组成：可溶性淀粉0.5～1.5%、多价胨或牛肉膏0～1.0%、氯化钠0～0.5%、磷酸二氢钾0～0.3%、磷酸氢二钾0～0.3%，硫酸镁0.05～0.15%、碳酸钙0.005～0.015%，硫酸锰0.05～0.15%，其余为黄浆水。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中的黄浆水是将新鲜黄浆水离心后的上清液。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述离心时的转速为5000～8000 rpm。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH值为6.0～8.0。
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说 明 书
一种高密度培养芽孢杆菌的方法
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技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种利用豆制品加工中产生的副产物黄浆水来高密度培养芽孢杆菌的方法。
[0001]
背景技术
芽孢杆菌是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，在其生长过程中可产生枯草菌素、多
粘菌素、短杆菌肽等活性物质，对肠道或植物致病菌具有明显的抑制作用，通过降低肠道环境中游离氧、促进乳酸菌等益生微生物的生长、肠道免疫调节等发挥益生作用。目前芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等菌种被广泛应用在农业植保、畜牧饲养业、环保三废处理等领域。目前已有大量的研究报道了高密度培养芽孢杆菌的方法，其中《一种高密度培养高活菌数枯草芽孢杆菌的方法》(CN20121054413.X)可到达108cfu/mL以上，《一种高密度培养枯草芽孢杆菌的方法》(CN201210056296.X)、《一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法》(CN201210056279.6)是以可溶性淀粉为碳源，蛋白胨为氮源，培养后的枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌数量分别可达到109 cfu/mL以上，而这些高密度培养方法都是以水作为溶剂，添加一定量的碳源、氮源和无机盐组成，经过振荡培养而收获菌体。[0003] 黄浆水是传统豆制品(豆腐、豆腐干、腐乳、豆腐皮)等生产过程中压滤成型后排出的废水，又称乳清废水。我国大豆制品的年消费量接近1000万吨，而在大豆制品加工过程中产生的黄浆水，总量大约为豆重的5.5～7倍。黄浆水含有大量的大豆低聚糖、蛋白质和其他生长因子，豆制品加工过程中黄浆水的随意排放，不但造成了能源的大量浪费，同时还污染了环境。利用黄浆水作为培养基原料来培养微生物或生产活性物质不仅有效降低了了生产的成本，同时还可以起到变废为宝的目的，提高黄浆水的工业附加值。
[0002]
发明内容
本发明旨在解决豆制品加工过程产生的黄浆水的利用问题，利用液态发酵来培养芽孢杆菌，在大量获取芽孢杆菌生物量的同时，降低微生物培养原料的成本，为此提供一种利用黄浆水来进行高密度培养芽孢杆菌的方法。[0005] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述高密度培养芽孢杆菌的方法包括如下步骤：（1）将保存的芽孢杆菌接种至活化培养基中，于30～42℃，转速100～250 rpm的条件下培养20～24 h，得活化后的芽孢杆菌；所述活化培养基由以下重量百分比的组分组成：可溶性淀粉0.5～1.5%、多价胨0～1.0%、氯化钠0～0.5%、磷酸二氢钾0～0.3%、磷酸氢二钾0～0.3%，其余为黄浆水；
（2）将活化后的芽孢杆菌按1～5%接种量接种至发酵培养基，于30～42℃，转速100～250 rpm的条件下培养20～36 h；所述发酵培养基由以下重量百分比的组分组成：可溶性淀粉0.5～1.5%、多价胨或牛肉膏0～1.0%、氯化钠0～0.5%、磷酸二氢钾0～0.3%、磷酸氢二钾0～0.3%，硫酸镁0.05～0.15%、碳酸钙0.005～0.015%，硫酸锰0.05～0.15%，其
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说 明 书
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余为黄浆水。[0006] 其中，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌或淀粉液化芽孢杆菌。
[0007] 优选地，所述活化培养基和发酵培养基中的黄浆水是将新鲜黄浆水离心后的上清液。
[0008] 优选地，所述离心时的转速为5000 rpm。[0009] 优选地，所述发酵培养基的pH值为6.0～8.0。
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[0010] 本发明方法培养的芽孢杆菌的细胞生物量达到10个/mL以上，比目前普遍的培养结果至少高出10倍以上。[0011] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）芽孢杆菌的发酵生产多以豆粕为生产原料，生产成本高，而对黄浆水的利用比较滞后，本发明将黄浆水作为一种新的原料来生产芽孢杆菌，可大幅降低芽孢杆菌的高密度培养成本；
（2）利用本方法培养的芽孢杆菌，活菌数可达到1010cfu/mL以上，提高了原料利用效率；
（3）解决了豆制品加工过程中黄浆水的利用问题，提高了豆制品加工业的工业附加值。具体实施方式[0012] 实施例1
（1）活化培养：将斜面中保存的芽孢杆菌接种至活化培养基中进行活化。活化培养基组成如下(按重量百分比)：可溶性淀粉0.5～1.5%、多价胨0～1.0%、氯化钠0～0.5%、磷酸二氢钾0～0.3%、磷酸氢二钾0～0.3%，黄浆水作为余量，搅拌均匀，加热。待上述各组分溶解后，用1 mol/L NaOH或HCl调节pH值至6.0～8.0，补充黄浆水至1000 mL。黄浆水的制备：将新鲜黄浆水进行离心，取上清液作为液体培养基原料。将配制好的培养基分装至250 mL的三角瓶中，每瓶装量为50 mL，用透气封口膜封口，121℃高压蒸汽灭菌30 min。活化培养条件为：30～42℃，转速100～250 rpm，振荡培养20～24 h。[0013] （2）发酵培养：将活化后的芽孢杆菌菌液按照1～5%接种量(v/v)接种至发酵培养基中。所述发酵培养基由以下原料组成(重量百分比)：可溶性淀粉0.5～1.5%、多价胨0～1.0%、氯化钠0～0.5%、磷酸二氢钾0～0.3%、磷酸氢二钾0～0.3%，硫酸镁0.05～0.15%、碳酸钙0.005～0.015%，硫酸锰0.05～0.15%，黄浆水作为余量，调整pH值为6.0～8.0。发酵培养条件为：培养温度30～42℃，转速100～250 rpm，接种量为1～5%(v/v)，振荡培养20～36 h。
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[0014] 上述方法培养的芽孢杆菌的细胞生物量达到10个/mL以上。[0015] 实施例2
（1）活化培养：将斜面中保存的芽孢杆菌接种至活化培养基中进行活化。活化培养基组成如下(按重量百分比)：可溶性淀粉0.5～1.5%、多价胨0～1.0%、氯化钠0～0.5%、磷酸二氢钾0～0.3%、磷酸氢二钾0～0.3%，黄浆水作为余量，搅拌均匀，加热。待上述各组分溶解后，用1 mol/L NaOH或HCl调节pH值至6.0～8.0，补充黄浆水至1000 mL。黄浆水的制备：将新鲜黄浆水进行离心，取上清液作为液体培养基原料。将配制好的培养基分装
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至250 mL的三角瓶中，每瓶装量为50 mL，用透气封口膜封口，121℃高压蒸汽灭菌30 min。活化培养条件为：30～42℃，转速100～250 rpm，振荡培养20～24 h。[0016] （2）发酵培养：将活化后的芽孢杆菌菌液按照1～5%接种量(v/v)接种至发酵培养基中。所述发酵培养基由以下原料组成(重量百分比)：称取玉米淀粉0.5～1.5%，牛肉膏0～1.0%，氯化钠0～0.5%、磷酸二氢钾0～0.3%、磷酸氢二钾0～0.3%，硫酸镁0.05～0.15%、碳酸钙0.005～0.015%，硫酸锰0.05～0.15%，再加入黄浆水，搅拌均匀，加热。待上述各组分溶解后，用1 mol/L NaOH或HCl调节pH值至6.0～8.0，补充黄浆水至1000 mL。黄浆水的制备：将新鲜黄浆水进行离心，取上清液作为液体培养基原料。将配制好的培养基分装至250 mL的三角瓶中，每瓶装量为50 mL，用透气封口膜封口，121℃高压蒸汽灭菌30 min。发酵培养条件为：培养温度30～42℃，转速100～250 rpm，接种量为1～10%(v/v)，振荡培养20～36 h。
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[0017] 上述方法培养的芽孢杆菌的细胞生物量达到10个/mL以上。
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