荧光分光光度法测维生素B2的含量

一、 实验目的 1. 了解荧光分析法的原理

2. 学习荧光公光光度计的使用方法 二、 实验原理

维生素B2在230—490nm范围波长的照射下，激发出峰值在526nm左右的绿色荧光，在pH=6-7的溶液里荧光最强，在pH=11时荧光消失。 三、 仪器与试剂

荧光分光光度计、容量瓶、玻璃棒

10.0ug/ml维生素B2标准液：称取10.0mg维生素B2，先溶解于少量的1%乙酸中，然后用1%乙酸定容至1000ml。溶液应该保存在棕色瓶中，置于阴凉处。 四、 实验步骤 1. 标准系列溶液的配制

取6个25ml比色管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0ml及2.5ml维生素B2标准溶液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。 2．测定荧光激发光谱和发射光谱

取上述第3号标准系列溶液，测定激发光谱和发射光谱。先固定发射波长为525nm，在400—500nm区间进行激发波长扫描，获得溶液的激发光谱和荧光最大激发波长λ

ex

再固定激发波长为λ

ex，在

480—600nm区间进行发射波长扫

em。

描，获得溶液的发射光谱和荧光最大发射波长λ3. 标准曲线的绘制

（1） 波长的设定：将激发波长和发射波长分别设定为上述得到的λ

值。

exT和λ

em

（2） 绘制标准曲线：用1号标准系列溶液将荧光强度“调零”，然后分别测定

2—6号标准系列溶液的荧光强度。 4. 未知试样测定

取未知试样溶液2ml置于25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，测定此溶液的荧光强度。

五、 实验数据及结果

（1）从绘制的维生素B2的激发光谱和发射光谱曲线上，确定其最大激发波长和最大发射波长；

（2）从绘制维生素B2的标准曲线，并从标准曲线上确定未知试样溶液中维生素B2的浓度；

（3）计算出原始未知试样中维生素B2的浓度。 六、 注意事项

测定的顺序要从稀到浓，以减小测量误差。 七、 思考题

（1）什么是荧光激发光谱？如何绘制荧光激发光谱？ （2）什么是荧光发射光谱？如何绘制荧光发射光谱？