省自然科学基础研究项目申请书

申报号 学科名称 项目类别 学科代码 A

某某省自然科学基础研究项目申请书

项目名称：鳖甲煎丸对肝纤维化细胞因子及其

相关细胞影响的研究

申 请 者： 所在单位（签章）：某某大学 主管部门： 某某省教育厅 联系电话： 5962476 电子信箱： 通讯地址： XX市XX道1号 邮政编码： 2222222 申请日期： 2002 年 8 月 20 日

某某省科学技术厅制

填 报 说 明

1、“申请书”用于申请某某省自然科学基金项目，由申请者负责填写。填写前请先查阅有关某某省自然科学基金项目申请办法及规定。申请书各项内容，要逐条认真填写，表达要明确、严谨，实事求是。外来语要同时用原文和中文表达，第一次出现的缩写词，须注明全称。

2、封面右上角“申报号”按照某某省科学技术厅分配的编号填写；“项目类别”栏由申请者填写, 申请项目属基础研究的此栏为“A”,属应用基础研究的为“B”。“学科名称”及“学科代码”请根据申报项目所属学科，按最新国家标准“学科分类与代码表”，填至三级学科分支。

3、基础研究是指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动；应用基础研究是指有广泛应用前景，但以获取新原理、新知识、新方法为主要目的的研究；“项目名称”应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）；“申请者”是指申请项目实际主持人。

4、在读（含在职）研究生和申请单位的兼职科研人员不得作为申请者提出申请，但可作为项目组成员参加研究。

5、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在研的省级以上科学基金项目数, 不得超过两项。同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个项目。

6、不具有副高以上专业技术职务或硕士以上学位的申请者，须有两名具有正高专业技术职务的同行专家推荐。

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简表

项目名称 鳖甲煎丸对肝纤维化细胞因子及其相关细胞影响的研究 项名称1 中医内科学 目申报学科 概名称2 中西医结合学 况 起止年限 2001 年 9 月至 2003 年9月 性姓名 别 项目主要成员 代码1 代码2 申请经费 360．1011 360．20 4万元 职称 年龄 学位 (职务) 现工作单位 签章 研究内容：本课题拟从实验及临床两方面进行研究： 1.实验部分：对实验大鼠免疫性肝纤维化模型分别给予鳖甲煎丸、丹参 注射液、秋水仙碱进行预防和治疗。检测生化指标，用放免法检测血清纤维化指标，用免疫组化法检测肝组织TGF－β1、PDGF、BFGF、Lｚ、CD3、项Dｍ、α－SMA、PⅢP、ColⅠ、ColⅢ，用原位杂交法检测肝组织内TGF－目β1ｍRNA。 主 2.临床部分：选择慢性肝炎、早期肝硬化患者作为观察对象，分为鳖甲要煎丸、丹参注射液、秋水仙碱组进行治疗，检测生化指标、血清纤维化指标、研血清TGF－β1，部分病人作肝组织病理检测、上述细胞因子及相关细胞检测。 究目标 内 1.阐明细胞因子及相关细胞在肝纤维化发生发展过程中的作用，进一步容揭示肝纤维化的病理机制。 和 2.阐明鳖甲煎丸抗肝纤维化的作用机理，为临床早期应用鳖甲煎丸预防目肝纤维化提供依据。 标 3.分析、比较鳖甲煎丸、丹参注射液、秋水仙碱3种药物的作用差异及毒副作用，为临床制定合理的治疗方案、恰当选药提供依据。

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一、本研究项目的立项依据和目标

1、本项目研究的意义及同类研究工作国内外研究现状与存在的问题，并列出主要参考文献： 肝纤维化是慢性肝病最重要的病理特征之一，也是慢性肝炎、肝硬化恶变的主要原因。肝纤维化的形成机理目前多认为是致病因子造成肝细胞（HC）损伤，引起枯否细胞激活，分泌多种细胞因子，随同血小板、肝窦内皮细胞和HC等分泌的多种细胞因子，与某些化学介质共同作用于肝星状细胞（HSC），使其激活转化为肌成纤维细胞，通过旁分泌和自分泌作用，使HSC增殖、合成大量的细胞外间质（ECM），ECM的分泌增加，降解减少，以致使其在肝内大量沉积，肝纤维化逐渐形成。因此在肝硬化形成之前，早期着手抗肝纤维化治疗是治疗肝病的关键。随着肝纤维化的形成与分解机理的阐明，以及有关调节因子的发现，抗肝纤维化的研究正活跃起来，初步发现的肝纤维化可逆转的证据，显示了抗肝纤维化的可能性与美好前景。 随着分子生物学技术的不断进步，肝纤维化的发生机制已从病理组织学的研究，发展到了细胞学的研究、细胞因子等分子水平的研究。目前研究已发现一些细胞因子与肝纤维化的形成有密切关系，其中最重要的是转化生长因β１（TGF－β１），ECM的合成与降解主要由TGF－β１调控，动物实验在肝纤维化过程中TGF－β1 及其蛋白表达不仅与Ⅰ、Ⅲ型胶原ｍRNA表达量的变化一致，且早于胶原表达，体外实验表明TGF－β１可以刺激肝储脂细胞（FSC）活化，合成ECM增多、降解减少。对病毒性肝炎肝组织进行免疫组化研究，随着肝纤维化程度的加重，TGF－β１在肝组织中的表达逐渐明显，并随病情加重而增高，同时与血清PⅢP、LN、HA、Ⅳ－Ｃ以及α－SMA和Ⅳ－Ｃ在肝组织中的表达成正相关。此外TGF－β１可通过增强其它细胞因子的作用或增加FSC分泌其它细胞因子、表达相应的受体而促进FSC的增殖，它能选择性并呈剂量依赖性增加FSC表达血小板衍生生长因子（PDGF），提高FSC与PDGF的结合位点，从而明显增强PDGF促进FSC增殖的作用。血小板衍生生长因子（PDGF）是一种普遍而强效的促分裂剂，目前的研究较少，国外的研究表明PDGF对FSC的活化、分裂和增殖等均有明显的促进作用，可使大鼠FSC细胞合成DNA较对照组增加18倍，进一步研究发现 ３

PDGF－BB和PDGF－AB是FSC的促分裂剂。碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）在创伤愈合过程中促使肉芽组织和纤维形成的作用已经明确，其与肝纤维化的关系研究刚刚开始，有研究发现BFGF明显促进大鼠的FSC的分裂和增殖，增强FSC的游走性，BFGF是间质细胞的促增殖因子，且能促进多种细胞产生ECM。总之细胞因子与胶原沉积的关系是通过对胶原生成细胞的调节作用而实现的。目前抗肝纤维化药物的研究主要有如下几方面：西药如干扰素、肾上腺皮质激素、秋水仙碱、Ｄ－青酶氨等，主要作用机理是抑制胶原合成、前胶原分子分泌以及胶原修饰酶的活性；不饱和卵磷脂、PHGF、钙通道阻滞剂、4－脯氨酰羟化酶等的研究尚在初期阶段，缺乏对细胞因子的作用的研究报道。上述药物有的副作用较大，有的尚未能应用于人体，有的作用机制还未明了，开发一个有效而副作用少的治疗药物尚需长期努力。中医药治疗慢性肝炎、肝硬化有悠久的历史及特有的优越性。近年来的研究有单味药研究、复方研究及实验研究。单味药研究如丹参及丹参酚性酸、桃仁及苦杏仁甙、汉防己及汉防己甲素、甜瓜及葫芦素、齐墩果酸、甘草甜素及甘草次酸等。复方研究主要集中在活血化瘀、清热利湿、疏肝理脾、补肾养阴之方剂，如血府逐瘀汤、小柴胡汤和大柴胡汤、当归补血汤、大黄蛰虫丸、软肝片、抗纤方、剔毒护肝方、肝纤康、扶正化瘀方、肝心康、861冲剂、319方脉络宁等。其中活血化瘀类方剂应用较多。从临床及实验研究结果来看，对临床症状、生化指标、血清学纤维化指标及病理改变等均有一定效果，表明中药可在多个环节抑制肝纤维化形成、促进胶原降解。诚然上述研究还存在一些不足，如抗纤维化研究多以实验动物为研究对象，与人体纤维化有一定差距；对照药多为秋水仙碱，尚缺乏中药之间的对照；有的科研方临床应用时间较短，治疗例数较少；或药物作用比较单一，难以对应本病较复杂的病机；中药复方多集中在药效学方面，对药理作用的研究较少。本领域分子水平的研究也刚刚起步，尤其是对细胞因子的研究。近年始有人在动物和人体通过检测肝组织以及血清中的TGF－β１来判断肝纤维化的程度；通过测定细胞因子判断IFN－γ及其他的抗肝纤维化药物的疗效；中药861合剂能抑制实验大鼠TGF－β１ｍRNA在肝组织内的表达。细胞因子的研究在阐明肝纤维化发生机理、物作用机理及确定病情程度、判断药 ４

临床疗效等多方面具有重要意义，将是今后研究的热点课题。 鳖甲煎丸是张仲景《金匮要略》中治疗疟疾徵瘕的名方，有可靠的临床应用基础，临床用于治疗肝炎、肝硬化、血吸虫病及热病后所致肝脾肿大，该药对改善症状、消除肝脾肿大有确切疗效，用于治疗肝癌也有一定效果。本方具有活血化瘀，软坚散结，利水祛湿,益气养血之功，功补兼施，作用全面，对应了本病复杂的病机，充分发挥了中药复方多途径抗肝纤维化的作用机制。近年来对鳖甲煎丸抗肝纤维化也有大组的病例观察，对静止性肝硬变40例患者的观察，治疗6个月后血中HPC－Ⅲ、Ⅳ－C、HA较治疗前明显下降,有显著性差异。对48例慢肝、肝炎后肝硬化，在常规中西药基础上加服鳖甲煎丸，临床疗效及血清肝纤维化指标的改善均优于常规治疗对照组。鳖甲煎丸对静止性肝硬化患者18例门脉血流动力学的观察，显示与治疗前相比有显著性差异，效果优于心得安对照组。 对大鼠四氯化碳模型的研究表明鳖甲煎丸对改善肝功、血清学指标及减轻肝脏病理改变均有明确效果。本课题组应用免疫性肝纤维化模型进行了研究，主要观察了鳖甲煎丸对ALT、AST、γ－GT、ALP、TP、ALB、HA、PCⅢ、Ⅳ－C以及病理形态学等内容。结果表明：鳖甲煎丸能有效地保肝降酶，抗肝细胞损伤，恢复肝细胞的功能，阻抑胶原的形成和促进胶原的降解，是一个疗效确切、起到综合作用的药物，可望成为一种多途径抗肝纤维化的复方中成药。本课题对其抗肝纤维化的机理进行更深入的研究，以核酸分子杂交和免疫组化技术对细胞因子及其相关细胞进行检测研究，探讨鳖甲煎丸阻止胶原形成抗肝纤维化的作用机理，并与中药丹参注射液、西药秋水仙碱作对照，比较它们之间的差别和优劣，为临床防治肝纤维化用药提供科学依据，并从分子生物学角度对仲景方药研究进行深化。 主要参考文献： [1]蔡卫民，陈峰．近年来肝纤维化主要新进展．临床肝胆病杂志，1998，14（2）：65 [2]Czaja MJ. Weiner FR, Flanders KC, et al. In vitro and in vivo association of transforming growth factor-β1 with hepatic fibrosis. J Cell Biol,1989,108:2477. [3]Nakatsukasa H, Evarts RP, Hsia CC, et al. Transforming growth factor-β1 and type I procollagen ranscripts during regeneration and early fibrosis of rat liver. Lab Invest 1990 63(2): 171～180 [4]Somasundaram R, Riecken EO, Schuppan D, et al. Matrix-binding of platelat-derived growth factor in hepatic fibrosis is mediated by collagens, Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ. Gastroenterology 1993 104(Suppl 4):A988

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[5]沈礼勇，李定国，陆汉明.细胞因子对贮脂细胞的调控与肝纤维化.上海第二医科大学附属新华医院.1997,24(12)530-532 [6]辛绍杰，王林杰，王松山，毛远丽，张世兰，陈黎明.转化生长因子β1与病毒性肝炎肝纤维化的关系.China J Hepatol, June 1997，Vol 5. No.2.66-67 [7]Pinzani M, Genhlini A, Caligiuri A et al. Hepatology, 1995;21(1)：232－239 [8]Pinzani M, Gesualdo L, Sabbah GM et al.J Clin Invest, 1989;84(6):1786-1793 [9]汪先恩，渡 纯夫，広濑美代子ゥ .肝脏，1995；36（3）：139－143 [10]张立煌，方海林，裘云庆，姚航平，李敏伟，刘克洲.病毒性肝炎患者血清转化生长因子β1 活性及其与肝纤维化的关系.Chin I Infect Dis, May 1997,Vol.15.No2;82-84 [11]徐冬波，翟为溶，周筱梅，庄丽，张月娥.细胞因子TGF－β1、PDGF－BB、bFGF在人肝纤维化中的作用.上海医科大学学报.1996,23(3)203-205 [12]刘三都，程明亮，谢朝良，等.大剂量丹参为主治疗慢性乙型病毒性肝炎160例，中西医结合肝病杂志，1993，3（3）：23 [13]徐列明，刘平，刘成，等.桃仁提取物抗实验性肝纤维化的作用观察，中国中药杂志，1994，19（8）：491 [14]范列英，孔宪涛，高春芳，汉防己甲毒对大鼠肝细胞，贮脂细胞DNA及胶原合成的影响.中华消化杂志，1994，14（50：281 [15]刘平，刘成，陈高朝，等.扶正化瘀319方治疗 [16]中药有效成分抗肝纤维化的研究现状.中草药，1996，27（3）：183 [17]杜斌.中药抗肝纤维化的研究近况.中医杂志，1999，40（10）：629 [18]白静丽.中医治疗肝纤维化的研究近况.长春中医学院学报，1999，15（3）：60 [19]于世瀛，贲长恩，杨美娟，等.清热利湿方药抗肝纤维化的形态学和免疫组织化学定量研究.北京中医药大学学报，1997，20(1):28 [20]程明亮，刘三都，等.肝纤维化的基础的研究及临床.人民卫生出版社，1996，8 [21]王泰龄，王宝恩，张怀宏，等,中药复方861对慢性肝炎肝纤维化治疗作用的病理研究.胃肠病学和肝病学杂志，1998，7（2）148-153 [22]邹米红．鳖甲煎丸为主改善静止性肝硬变纤维化指标４０例．南京中医药大学学报，1998，14（15）：312 [23]吴健．鳖甲煎丸抗肝纤维化５０例临床观察，浙江中医杂志．19 [24]万培祥．鳖甲煎丸对肝硬化门脉血流动力学的影响．南京中医药大学学报．1999,99,14(2)：125 [25]姚真敏，吕圭源，赵治友．鳖甲煎丸抗肝纤维化作用的试验研究．浙江中医学院学报．1997．21（1） [26]任周新．鳖甲煎丸对大鼠四氯化碳肝损伤治疗作用的研究．某某中医药学刊．1995．10(2) [27]于世瀛，贲长恩，杨美娟，等．免疫性与化学性所伤肝纤维化动物模型的比较．试验动物科学与管理，1995；12（4）：5 [28]朱木梁，宋健，张兴荣，等.苦参素对成纤维细胞增殖. 形态学及转化生长因子β1的影响.中国新药与临床杂志，2000；6：461 [29]朱清静，邓欣，杨玲，等.剔毒护肝方药物血清对大鼠肝星状细胞产生I型胶原及转化生长因子β1的影响.中西医结合肝病杂志，2000；6：25 [30]赵治友，姚真敏，钟庆平，等.中药鳖甲煎丸抗肝纤维化作用的临床研究.中西医结合肝病杂志，2001；3：136.

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2、本项目研究目标、内容和拟采取的研究方法： 研究目标 1.阐明细胞因子及相关细胞在肝纤维化发生发展过程中的作用，进一步揭示肝纤维化的病理机制。 2.阐明鳖甲煎丸抗肝纤维化的作用机理，为临床早期应用鳖甲煎丸预防肝纤维化提供依据。 3.分析、比较鳖甲煎丸、丹参注射液、秋水仙碱3种药物的作用差异及毒副作用，为临床制定合理的治疗方案、恰当选药提供依据。 研究内容和方法：本课题拟从实验及临床两方面进行研究： 1.实验部分：对实验大鼠免疫性肝纤维化模型分别给予鳖甲煎丸、丹参注射液、秋水仙碱进行预防和治疗。检测生化指标；血清纤维化指标，采用放免法检测；肝组织TGF－β1、PDGF、BFGF、Lｚ、CD3、Dｍ、α－SMA、PⅢP、ColⅠ、ColⅢ，采用SABC－AP免疫组化法进行检测；检测肝组织内TGF－β1ｍRNA，用原位杂交法。 2.临床部分：选择慢性肝炎、早期肝硬化患者作为观察对象，分为鳖甲煎丸、丹参注射液、秋水仙碱组进行治疗，检测生化指标、血清纤维化指标、血清TGF－β1，部分病人作肝组织病理检测、上述细胞因子及相关细胞检测。 ７

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3、研究工作的预期结果或目标及提供形式。如系理论成果，应写明在理论上解决哪些问题及科学意义；如系应用性成果或基础性资料，应写明其应用前景： 本课题运用核酸分子杂交技术和免疫组化技术，检测免疫性肝纤维化大鼠及慢性肝炎，早期肝硬化患者肝组织细胞因子及相关细胞，研究结果： 1、可阐明细胞因子TGF－β1、PDGF、bFGF及其生成和效应细胞在肝纤维化发生发展过程中的作用，更加深入的揭示肝纤维化的病理机制。 2、阐明中药鳖甲煎丸抗肝纤维化作用机理，为该药用于临床预防和治疗肝纤维化（尤其是预防）提供依据。 3、通过与目前临床常用中、西药物进行对照研究，分析各药的作用特点，为临床制定治疗方案，恰当选药提供依据。 4、运用分子生物学方法对经方作用机制进行深入研究，是对张仲景学说研究的深化。 我国是乙型肝炎高发区，肝硬化是严重威胁患者生命的重大疾病，阻止和延缓肝纤维化的发生发展，是治疗慢性肝病防止肝硬化的关键，因此本课题具有重要的理论价值和临床指导意义。 本研究结果提供形式是研究报告及论文。 ９

二、研究方法和技术路线

1、拟采取的理论分析、计算、实验方法和步骤及其可行性： 一、实验研究： （一）实验材料 1.实验动物：雄性Wistar大鼠，体重180-200g，120只。 2.实验药品：鳖甲煎丸（杭州胡庆余堂制药厂生产），丹参注射液（上海第一制药厂生产），秋水仙碱片（西双版纳制药厂生产）。 3.实验试剂： 猪血清：购新鲜猪血，离心制血清，滤过除菌，分装，置低温冰箱备用。 抗PDGF-BB、抗BFGF、抗溶菌酶Lz、抗α平滑肌肌动蛋白α-SMA、抗CD3、抗结蛋白Dm、抗Ⅰ型胶原ColⅠ、抗Ⅲ型胶原ColⅢ、TGF-β1原位杂交试剂盒（TGF-β1 ISH Detection Kit）、SABC-AP免疫组化染色试剂盒。（以上购自博士德公司） 4．实验仪器： ⑴仪器 石蜡切片机、恒温箱（20-60℃）、烤箱、低温冰箱（-70℃）、冰箱（4℃）、普通天平、电子天平、光学显微镜、高压蒸汽消毒器、各式加样器、全自动生化分析仪、放免γ测量仪、离心机、净化工作台、电子恒温水浴锅、显微照相装置、图象分析仪。 ⑵其他材料 染色缸、量筒、量杯、烧杯、漏斗、广口瓶、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀、离心管、试管、吸管、注射器、针头等。 （二）实验方法 1．动物造模：本实验选用猪血清诱导免疫损伤性肝纤维化模型。采用未灭活猪血清腹腔注射，每周两次，每次0.5ml/只，连续10周。5周后即可形成肝纤维化。病理变化为肝小叶内细胞变性、坏死，纤维间隔增厚，假小叶形成。 2．分组：120只大鼠随机分为8组，正常对照组、病理模型对照组、鳖甲煎丸预防组、鳖甲煎丸治疗组、丹参注射液预防组、丹参注射液治疗组、秋水仙碱预防组、秋水仙碱治疗组。 3．给药方法：鳖甲煎预防组于造模同时给药，每天上午灌胃1次，0.5g/kg丹参注射液每天上午1次，慢注，0.75ml/kg；秋水仙碱0.3mg/kg每天上午灌胃1次。连续10周，各治疗组于造模第6周给药，方法及剂量同预防组，至第10周结束。各组均饮用自来水，食用普通块状饲料。 4．各组均于造模10周结束后断头处死动物，采血制血清。同时取0.3×0.5cm3肝组织，各组取材部位基本一致，4％多聚甲醛固定液固定，固定液中加0.1%的DEPC处理，作石蜡切片。 （三） 检测指标及方法 1．实验大鼠一般情况。 2．实验大鼠血清酶及血清蛋白含量：ALT、AST、γ-GT用速率法、ALP用AMP

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缓冲法、TP用双缩尿法、ALB用溴甲酚绿法。全自动生化仪检测。 3．实验大鼠血清纤维化指标：HA、LN、PCⅢ、IV-C含量，用放射免疫法（RIA）测定。SN-695B型智能放免测量仪检测。 4．免疫组化的定位及定量：细胞因子PDGF-BB、bFGF及Ⅰ、Ⅲ型胶原、Lz、CD3、Dm、α-SMA、ColⅠ、ColⅢ。免疫组化拟采用SABC-AP免疫组化染色试剂盒进行检测（武汉博士德公司）。Strept Avidin－Biotin Complex，该法具有高敏感，低背景和操作简便的优点。 操作程序：载玻片防脱片处理，选用APES。组织及时常规固定，制成石蜡切片。切片经常规脱蜡至水酶消化，滴加0.1％胰蛋白酶30分钟。蒸馏水洗，滴加抗原修复液，蒸馏水洗。滴加正常血清封闭液。滴加适当稀释的一抗，20－37℃1～2小时或4℃过夜。0.1M PBS洗2分钟×3次。滴加二抗，20－37℃20分钟。0.1M TBS洗2分钟×3次。滴加SABC-AP，20－37℃20分钟。0.1M TBS洗5分钟×4次。水洗一次。显色，BCIP/NBT用0.1M TBS（PH9.0-9.5）按1：20比例稀释，混匀，加至切片。20－37℃显色10－30分钟，镜下控制反应时间。蒸馏水洗涤。核固红轻度复染。水洗，干燥后水溶性封片剂封片（60℃） 5．肝组织内TGF-β1mRNA：用原位杂交法检测。用TGF-β1的寡核苷酸探针经地高辛标记，按核酸杂交中碱基配对原则与组织中相应的基因片段杂交，所形成的杂交体经显色反应后在光学显微镜下观察。拟采用博士德生物工程公司生产的TGF-β1原位杂交检测试剂盒检测。 操作程序：组织及时固定，固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理。石蜡切片经常规脱蜡至水。3%H2O2室温处理10分钟以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗涤2次。暴露mRNA核酸片段，切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃消化10--60分钟。预杂交，按每张切片20μι加预杂交液。放入湿盒，恒温箱37—40℃2—4小时。杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。加封口膜，盖在切片上。恒温箱40-42℃杂交过夜。杂交后洗涤，去掉封口膜，滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化过氧化物酶。DAB显色，使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。充分水洗。必要时苏木素复染，充分水洗。酒精脱水，二甲苯透明，封片。 结果观察：TGFβ1 mRNA的细胞胞浆着色呈棕黄色。 6．肝脏病理定性定量观察：ＨＥ及ＶＧ染色，于光学显微镜下观察，摄取照片。并按1994年世界胃肠病大会及世界肝病学术大会推荐的关于慢性肝炎的诊断、分级和分期的建议，将肝纤维化分为四级。 二、临床研究 （一）病例选择： 1．选择慢性肝炎和早期肝硬化患者、中医辨证属血瘀兼湿证,血清肝纤维化指标HA、PCⅢ、LN中至少2项明显异常，组织学检查提示肝纤维化分期在S2以上，无明显黄疸、腹水、病性相对稳定者作为观察对象。 2．诊断标准：根据世界胃肠病大会（洛杉矶1994年10月）及世界肝病学术

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大会（坎肯1994年6月）推荐的关于慢性肝炎诊断、分级和分期的建议。肝纤维化病理分期标准：纤维化程度S0无，S1无或汇管区扩大纤维化，S2汇管区周围纤维化或纤维隔形成，小叶结构保留，S3纤维化伴小叶结构紊乱，无肝硬化，S4可能的或肯定的肝硬化。 3．中医辨证标准：参照中国中医药学会内科肝病专业委员会制定的病毒性肝炎中医辨证标准血瘀痰湿型.。 （二）实验方法 1．分组：进行随机平行对照实验,将符合纳入标准的患者采用区组随机方法分为3组，每组30例。 2．用药：鳖甲煎丸组，每次3g，每日3次，口服。丹参注射液组，10～20ml，加入10％葡萄糖静脉滴注，每日1次。秋水仙碱组，每日1mg，每周5天，口服。3组均可根据病情给予对症治疗及支持疗法。 3．疗程：3组均以三个月为1疗程，1－2个疗程后判断疗效。 （三）观察指标 1．一般项目，血、尿、便常规化验，心、肝、肾功能检查。 2．临床症状与体征。 3．B超检查。 4．血清酶、血清纤维化指标检测及方法同实验研究部分。 5．血清TGF-β1 采用MVLU细胞生长抑制ＭＴＴ法。 6．部分病人作肝组织病理定性定量观察、肝组织内TGF-β1mRNA、细胞因子及相关细胞检查，内容及方法同实验部分。 三．统计学处理 数据采用SPSS 10.0 for windows统计软件处理，计量资料采用T检验和方差分析，计数资料采用χ2检验，等级资料采用秩和检验。 2、研究工作的整体安排： 2001年9月—2001年12月进行动物实验造模，用药观察。 2002年1月—2002年6月进行实验研究各项指标测定。 2001年9月－2003年12月进行临床观察，检测各项指标。 2004年1月—2004年4月整理资料，进行数据处理，撰写研究报告。 １２

三、实现本项目预期目标已具备的条件

1、与本项目有关的工作基础及实现本项研究已有的主要仪器设备；尚缺的仪器设备及解决途径。 一、工作基础： 我们已进行了鳖甲煎丸对免疫性实验大鼠肝纤维化作用的实验研究，以秋水仙碱作对照，对实验大鼠血清中酶类含量、蛋白含量、PⅢP、IV－C、LN含量以及实验大鼠组织形态学进行了检测和统计分析。实验结果表明鳖甲煎丸能够有效地保肝降酶，抗肝细胞损伤，恢复肝细胞的功能，阻抑胶原的合成并促降解，有较好的抗肝纤维化作用。我们已经运用免疫组化方法（Strept Avidin－Biotin Complex法武汉博士德公司）进行了实验模型大鼠肝组织PDGF-BB、BFGF细胞因子检测预实验。运用原位杂交法 （TGF-β1寡核苷酸探针经地高辛标记）进行了实验模型大鼠肝组织内TGF-β1mRNA检测预实验。 二、工作条件 某某大学医学院实验动物中心可提供实验所需的合格动物。 本研究所需的药物、试剂均可从有关代理商或生产厂家购买。某某大学中心实验室具备研究所需的大部分仪器。可以进行血清酶类、蛋白、纤维化指标的检测，并对组织形态进行观察。细胞因子及相关细胞的检测在某某大学医学院的分子生物实验室进行。 尚缺图象分析仪，已与北京中医药大学联系，可租借该仪器。 １３

2、申请者和项目组主要成员的主要学历和研究工作简历，近期发表的与本项目有关的主要论著和科研成果名称及或奖情况 四、申请者正在承担的其他研究项目

攀登计划、863、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系情况： 1、鳖甲煎丸对肝纤维化血清学指标影响的研究，某某省科委1999年－2001年，课题负责人，是本课题的前期基础工作，现已基本完成，正在总结，撰写研究报告。 2、鳖甲煎丸与鳖甲胶丸抗肝纤维化作用及机理的比较研究，某某省教委，2000年－2003年，课题负责人，为鳖甲煎丸剂型改革奠定基础，与本课题内容相关。 五、申请者承担（负责或参加）省级以上科学基金资助项目的情况 项目编号 项目名称 起止时间 负责或参加 项目进展

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六、申请项目经费预算（单位：万元）

申请资助经费 总 额 4万元 2002年 3万元 2003年 1万元 金额（万元） 2.8 0.8 1.4 根据目前市场价格估算 根据目前市场价格估算 根据目前情况估算 总 额 1 其他经费来源 2002年 0.5 计算根据及理由 2003年 0.5 预算支出科目 1、仪器设备费 2、实验材料费 3、科研业务费 4、实验室改装费 5、协作费 6、管理费

七、申请者所在单位审查意见（对本项目的可行性、特色和创新之处、申请和项目组

主要成员的素质与水平等签署具体意见）

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（签 章） 年 月 日 八、申请者主管单位审查意见（签署经费预算是否合理，有无其他经费来源能否保证研究计划实施所需的人力、物力、工作时间等基本条件的具体意见） （签 章） 年 月 日

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