冻干乳酸菌菌种增菌培养基的优化

维普资讯 http://www.cqvip.com 冒震园　受ＣＨＩＮＡ　ＤＡＩＲＹ　ＩＮＤＵＳＴＲＹ　冻干乳酸菌菌种增菌培养基的优化　张建友，李艳武，赵群波，霍贵成　（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨１５００３０）　摘要：发酵刺是影响整个酸奶生产的关键因素之一，冷冻干燥乳酸茵发酵剂的使用简化了乳品企业的生产工艺，　提高了企业产品质量，避免了因微生物力量不足而造成的菌种质量不佳等问题。确定的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的　增茵配方分别为：胰蛋白胨质量分数０．５％，葡萄糖质量分数１％，酵母粉质量分数０，７，鱼肉蛋白胨质量分数０，５％，　乳糖质量分数ｌ％，酵母粉质量分数０．３％；培养后茵数达到１０　ｍＬ。　关键词：冻千；乳酸茵；增茵培养基　中图分类号：ＴＳ２０１．２５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１—２２３０（２００２）０５—００４０—０４　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ　ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ＺＨＡＮＧ　Ｊｉａｎ—ｙｏｕ，ＬＩ　Ｙａｎ—ＷＵ，ＺＨＡ０　Ｑｕｎ—ｂｏ，ＨＵ０　Ｇｉｕ—ｃｈｅｎｇ　（Ｆｏｏｄ　ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１　５００３０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｔａｒｔｅｒ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｙｏｇｈｏｕｒｔ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ，Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｒｅｃｔ・ｖａｔ　ｓｅｔ　ｓｔａｒｔｅｒ　ｍａｋｅｓ　ｉｔ　ｓｉｍｐｌｅ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｙｏｇｈｏｕｒｔ，ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎｄ　ａｖｏｉｄ　ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｐｒｏｂｌｅｍ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｈｏｒｔａｇｅ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｏｗｅｒｆｕｌｎｅｓｓ，Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｓ　ｔ　ａｎｄ　Ｌ　ｂ　ｉｓ　ｇｉｖｅｎ　ｂｅｌｏｗ：ｔｒｙｐｔｏｎｅ　０，５％，Ｇ　０，５％。ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｐｏｗｄｅｒ　０，７％，　ｐｏｌｙｐｅｐｔｄｎ　０，５％，ｌａｃｔｏｓｅ　１％，ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｐｏｗｄｅｒ　０．３％，ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｉｓ　ｕｐ　ｔｏ　１０　ｍＬ～。　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙ；ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅ　用，或常常配合以其他生长因子方可使用。使用乳清基质培养　１　引　言　１．１　目的与意义　基时，乳清蛋白易发生热变性，易产生沉淀，同时乳基质和乳清　基质培养基因其增殖慢或不易分离菌体而不宜采用　】。本研　究根据嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的营养需要，采用常用　的碳源、氮源、酵母粉以及缓冲盐类，通过正交实验设计进　行增菌培养基的优化，为将来直投型酸奶发酵剂的制备奠定　基础，这将对未来发酵剂的生产带来巨大经济效益。　１．２　国内外研究现状　１、２．１　国外增茵培养基研究现状　酸奶对人体有平衡肠道菌群和整肠、清除血清中胆固　醇、抗衰老、延长寿命、防止和降低乳糖不耐症、提高人体　对钙、磷、铁的吸收等作用…。　随着酸奶制作技术的发展，乳酸菌发酵剂制备方法也得　到了相应的发展与提高。传统发酵剂一般是将少量自己保存　的菌种经活化、扩增制成普通液体发酵剂。这种发酵剂由于　含菌量低（１０　～１０　ｍＬ　），所以用量大，而且制作过程繁　杂，质量不易控制，容易污染杂菌和噬菌体。由于这些弊端　的存在，人们迫切需要一种能直接用于生产的高浓度发酵　剂。　早在８０年代初，全苏乳品工业研究所就采用冷冻干燥　法，研制成含有嗜温嗜热的乳酸链球菌和嗜酸乳杆菌的干燥　菌种，所用培养基由乳清、水和缓冲盐类组成。　目前国外乳酸菌发酵剂的工业生产培养基主要有４种：　（１）脱脂乳或ＲＳＭＰ中加生长促进剂同时进行ｐＨ值控　制，这种培养基很难收集到菌体，添加柠檬酸盐后有所提　高。　（２）水解乳加生长促进剂、ｐＨ值控制，解决了收集问　题，但是费用昂贵，而且很难准备　【。　（３）乳清基质加生长促进剂、ｐＨ值控制，热处理引起蛋　白质沉淀，需要澄清过滤，费用不是很高。　（４）乳糖加生长促进剂、ｐＨ值控制，这种培养基简单而　冷冻干燥乳酸菌发酵剂可以使乳酸菌发酵剂的生产专业　化、社会化、规范化和统一化，从而使发酵乳产品的生产标准　化，提高发酵乳产品质量，保障了消费者的利益和健康　【。　增菌培养基大致分为配制培养基、乳基质培养基、乳清　基质培养基。后两者因其增殖慢，或不易分离菌体而不宜采　收稿日期：２００２—０７—２５　作者简介：张建友（１９７６一），男，硕士研究生．　从事食品营养方面的研究。　２０ｏ２年第３。卷第５期（总第１５。期）　维普资讯 http://www.cqvip.com 且便宜，热灭菌液比较容易，是一种工业生产乳酸菌的最好　方法。　１．２．２　国内现状　表１　基础培养基优化正交实验因素水平（　（３　））　房兴利等　用改良的ＭＲＳ培养基和葡萄糖酵母膏培养基　Ｉ　２　３　胰蛋白胨　大豆蛋白胨　鱼肉蛋白胨　乳糖　蔗糖　葡萄糖　Ｏ．３　Ｏ．５　Ｏ．７　分别培养保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，４０℃培养４８　ｈ，收　集的菌体分散在０．１　ｍｏｌ／ｍＬ、ｐＨ值为４．２的缓冲溶液中，　能制成菌数为１０　ｍＬ　的菌悬液。刘宇峰等１２１用含有胰蛋白　胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、葡萄糖、ＮａＣ１、Ｌ一半胱　氨酸的复合培养基和天然脱脂乳培养基分别培养保加利亚乳　杆菌和嗜热链球菌。结果表明，脱脂乳优于复合培养基。史　缓英等对传统乳酸菌Ｌ　ｂ和ｓ　ｔ进行了高浓度混合培养的研　究，确定了培养基配比为脱脂奶粉质量分数为１０％，乳清粉　质量分数为１％，酵母膏质量分数为１％，磷酸氢二氨质量分　数为０．２５％。培养过程控制ｐＨ为５．８～６．３，菌数达到　２５．７５×１０　ｍＬ～。黄良昌等　从多种培养基中优选出改良的　ＭＲＳ培养基作为保加利亚乳杆菌的增菌培养基，同时将初始　（５）菌液吸光值（ＯＤ　。。）的测定。用ＵＶ２４０１ＰＣ紫外分光　光度计在６００　ａｍ条件下比色，测定菌液的吸光值。　（６）菌液ＰＨ值的测定。用ＰＨｓ一３ｃ型精密ＰＨ计在室　温下测定ｐＨ值。　（７）菌液滴定酸度的测定。ＮａＯＨ滴定法，按ＧＢ５４０９—　８９方法测定。　（８）增菌液的配制。按照正交设计表分别配制９种增菌　培养基，增菌培养基经１２１℃、１５　ｍｉｎ灭菌。　（９）菌体培养。将ＭＲＳ培养基中的Ｓ．ｔ与Ｌ　ｂ按质量分　数为１％和５％的接种量接种于９种增菌培养基中，于３９℃下　培养，２４　ｈ后测定ＯＤ值与ｐＨ值。　（１０）生长曲线的测定。菌种活化扩培后，以质量分数　ｐＨ值调到５．８，在４０℃条件下培养，添加生长促进剂后菌落　数达到１０　ｍＬ　以上。　２　材料与方法　２．１　实验村料　为１％接种量接种于优化出的增菌培养基中，在３９℃条件下　培养，分别于０，３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４　ｈ取样测定　氮源：胰蛋白胨，大豆蛋白胨，鱼肉蛋白胨，酵母浸出　粉，牛肉膏。以上均为生化级试剂。　吸光值、ｐＨ值和滴定酸度，以培养时间为横坐标，相应的吸　光值、ｐＨ值和滴定酸度为纵坐标，绘制生长曲线　】。　碳源：乳糖，蔗糖，葡萄糖。均为分析纯试剂。　盐类：柠檬酸钠，磷酸氢二钾，乙酸钠，Ｍ　ｇＳＯ　・７Ｈ　０，　ＭｎＳＯ　・Ｈ　０。以上均为分析纯试剂。　材料：酵母粉。　３　结果与讨论　３．１　增菌培养基的优化结果　３．１．１　球菌分析结果　吐温８０浓度为０．１　ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠，质量分数为１％酚　酞试剂，革兰氏染色剂。　菌种：嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌（畜产品加工研究所　保藏）。　２．２仪器与设备　按表１的因素水平表，采用　（３　）正交实验设计表实施　实验，以ｐＨ值、吸光值为指标，测定结果见表２；以ＯＤ值　为指标的极差分析见表３；以ｐＨ值为指标的极差分析见表　４。从表３可以看出，３个因素对指标值的影响是Ａ＞Ｂ＞Ｃ，即　氮源对指标的影响最显著，碳源次之，酵母粉的添加量对指　标影响最小。从表４可以看出，因素Ａ对ｓ　ｔ增菌效果显　著，综合两表可以看出，因素Ａ的一水平、因素Ｂ的三水平　电子天平，电子显微镜，恒温培养箱，超净工作台，高压灭　菌器，干燥箱，微波炉，ＵＶ２４０１　ＰＣ紫外分光光度计，ＰＨＳ一３Ｃ型　精密ＰＨ计。　２．３　方法　和因素Ｃ的三水平组合在一起，吸光值最高，ｐＨ值最低，那　么试验结果优化的最佳增菌培养基配方应为Ａ．Ｂ，Ｃ　，方差分　析也得到同样的结果即胰蛋白陈质量分数为０．５％、葡萄糖质　量分数为１％、酵母粉质量分数为０．７％。　３．１．２　杆菌分析结果　（１）菌种活化。将实验室保藏的冻干菌种用质量分数为　１１％的脱脂乳传代活化３次。　（２）镜检。待活力达到一定程度后，将其划线接种到　ＭＲＳ固体培养基中培养约３２　ｈ，长出单个菌落后，挑取菌落　一按表１的因素水平表，采用Ｌ９（３　）正交实验设计表实施　实验，以ｐＨ值、吸光值为指标，测定结果见表２。以ＯＤ值　为指标的极差分析见表５；以ｐＨ值为指标的极差分析见表　６。由上述两表的实验结果可以看出，以ＯＤ值为指标时的最　优组合为Ａ，Ｂ－Ｃ－，而以ｐＨ值为指标时的最优组合为Ａ。Ｂ，Ｃ，，　因此进行了保加利亚乳杆菌的验证实验，结果见表７。　半进行革兰氏染色镜检，确定是纯菌种。　（３）扩增培养。将确认纯菌种菌落的另一半接种到ＭＲＳ　液体培养基中培养约４８　ｈ。　（４）增菌培养基的优化。柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸氢二　钾、ＭｇＳ０　・７Ｈｚ０、ＭｎＳＯ　・Ｈ　０、吐温８０的用量固定，采用　正交实验设计（Ｌ９（３　））优化碳源（Ａ）、氮源（Ｂ）和酵母浸出粉　（Ｃ）的用量。因素水平见表１。　由上述实验结果可以看出，Ａ　Ｂ。Ｃ。组合的ｐＨ值显著低于　Ａ－Ｂ，Ｃ，组合，而ＯＤ值又显著高于Ａ。Ｂ，Ｃ，组合。因此，可以　ＶｏＬ　３０，Ｎｏ．５　ｚ　ｃｔｏ　，☆　维普资讯 http://www.cqvip.com 判定杆菌的最佳增菌培养基配方为Ａ，Ｂ　Ｃ　组合，即鱼肉蛋白　３．２　验证实验　胨质量分数为０．５％，乳糖质量分数为１％，酵母粉质量分数　将优选出的增菌培养基Ａ　ｃ，和Ａ，Ｂ　ｃ，经ｌ２ｌ℃、ｌ５　ｍｉｎ　为０．３％。　灭菌后，按质量分数为ｌ％和５％的接种量接人嗜热链球菌和　表２　增菌培养基优化的正交实验结果（１－９（３　）　保加利亚乳杆菌，于３９℃下培养　２４　ｈ，测定其ＯＤ值和ｐＨ值以验证　前期实验结果：球菌ＯＤ值为　ｌ　胰蛋白胨　乳糖　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　Ｏ　０．０１４０，ｐＨ值为４．６２；杆菌ＯＤ值　Ｏ．ｏｏ８６　７．２ｌ　０．７８７８　５．８５　３　５　７　５　７　３　７　３　５　２　胰蛋白胨　蔗糖　为０．４７３２，ｐＨ值为５．９０，与前期　Ｏ．３６５Ｏ　６．Ｏ６　１．２９Ｏ３　５．２６　３　胰蛋白胨　葡萄糖　０．９１４７　５．２５　１．５Ｉｌ９　５．ｏｏ　实验结果相符。　４　大豆蛋白胨　乳糖　０．０１４８　７．２７　１．１Ｏ２ｌ　５．７５　３．３　生长曲线的测定　５　大豆蛋白胨　蔗糖　Ｏ．３ｏ９Ｉ６　５．９Ｏ　１．６３４７　５．２４　为了解嗜热链球菌和保加利亚　６　大豆蛋白胨　葡萄糖　０．１８４４　６．８６　０．４４７５　５．８９　乳杆菌在增菌培养基中的生长过程　７　鱼肉蛋白胨　乳糖　Ｏ．Ｏ１２４　６．９７　１．１３０５　５．６０　从而掌握发酵最适收获期，进行了　８　鱼肉蛋白胨　蔗糖　ｏ．０１７５　７．１２　０．４０４７　５．８８　生长曲线测定。间隔３　ｈ测定菌液　９　鱼肉蛋白胨　葡萄糖　仅Ｏ２Ｏ２　６．８４　１．６２１９　４．８２　的吸光值、ｐＨ值和滴定酸度，绘制　表３　ｓ　ｔ增菌培养基优化中指标的极差分析结果（ＯＤ值）　表７　保加利亚乳杆菌的验证实验　０．４２９４　Ｏ．Ｏ１１９　Ｏ．Ｏ７Ｏ２　６．３１　０．２０４７　５．９２　０．４７３０　０．１６９６　Ｏ．２３Ｏ７　０．１３３３　Ｏ．Ｏ１６７　０．３７３１　Ｏ．４１２２　Ｒ　０．４１２７　０．３６１２　０．３４２０　生长曲线，如图１—４所示。由图１—４可以看出，嗜热链球　菌和保加利亚乳杆菌的ＯＤ值从一开始急增，经过较短的延迟　表４　Ｓ．ｔ增菌培养基优化中指标的极差分析结果（ｐＨ　ｉｌ１）　期后即进人对数生长期，到１２　ｈ和１５　ｈ后达到高峰即基本保　持不变，表明此后菌数不再增加。酸度和ｐＨ值在开始时有一　个明显的迟缓期，３　ｈ后都急速变化，这说明菌种进人对数生长　ＫＩ　６．１７　７．１５　７．ｏ６　期以后，菌数增加较快。酸度一直随着时间的延长而升高，ｐＨ　６．６８　６．３６　６．７２　值随着时间的延长而降低，证明乳酸菌的浓度随着菌株的生　６．９８　６．３２　６．０４　长一直在升高。最后酸度和ｐＨ值基本维持不变，开始进入生　Ｒ　Ｏ．８ｌ　ｏ．８３　１．０２　长稳定期，菌数基本保持不变，滴定酸度曲线、ｐＨ值曲线渐　趋平衡。　表５　Ｌ　ｂ增菌培养基优化中指标的极差分析结果（ＯＤ值）　这种情况意味着１２　ｈ和１５　ｈ以后已经明显不利于嗜热链　球菌和保加利亚乳杆菌的生长繁殖，生长曲线亦呈下降趋势。　将ＯＤ值、ｐＨ值及酸度曲线作比较，在对数生长期，菌落生长繁　ＸＪ　１．１９６７　１．ＯＯ６８　０．５４６７　殖快，代谢快，因此ＯＤ值、ｐＨ值及酸度变化趋势快；在生长稳　１．Ｏ６１４　１．１Ｏ９９　１．３３８ｌ　定期ＯＤ值不变而ｐＨ值和酸度变化趋势趋缓，但仍稍稍有上　１．Ｏ５２４　１．１９３８　１．４２５７　升趋势，说明代谢产物不再增加，乳酸菌的浓度也已经基本保　０．１４４３　０．１８７Ｏ　ｏＩ　８７９０　持不变。在衰亡期、ＯＤ值、ｐＨ值及酸度基本维持不变，说明低　ｐＨ值对乳酸菌的生长有明显的抑制作用　。　表６　Ｌ　ｂ增菌培养基优化中指标的极差分析结果（ｐＨ值）　综上所述，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的最适收获期　应为９～１５　ｈ和１２～１８　ｈ。考虑到在对数生长期末、稳定期　初收获可提高其在冷冻干燥过程中的存活率，这里选择在发　５．３７　５．７３　５．８７　酵培养ｌ２　ｈ和１５　ｈ收获。　５．６３　５．４６　５．２８　增菌液配方设计中因营养要求复杂，影响生长的因素　Ｊ　５．４３　５．２４　５．２８　多。在实际工作中还应做其他条件的优化，如增菌液氧化还　Ｏ．２６　０．４９　Ｏ、５９　原电势、温度等，因工作量大而时间有限，只能对配方作初　步的优化设计”・。　２ｏ０２年第３。卷第５期（总第ｌ５。期）　维普资讯 http://www.cqvip.com ｔ／ｈ　图１　嗜热链球菌生长曲线　图４　保加利亚乳杆菌生长曲线测定中ｐＨ值　和滴定酸度的变化　ｔ．－－　＼　诖　壤　参考文献：　【１］张兰威，李妍．分纯菌发酵特性及乳酸链球菌对其酸奶后酸化的　影响研究【Ａ］．首届中国乳品工业学术研讨会论文集ｆＣ】．哈尔滨：　图２　嗜热链球菌生长曲线测定中ｐＨ值和　滴定酸度的变化　１．２　１．０　Ｏ．８　中国乳品工业杂志社，２００１．３５—３８．　【２】刘字峰，王金英．直接使用型酸奶发酵剂的研制【ｊ】．中国乳品工　业，１９９５，２３（６）：２７４—２７９．　【３　Ｊ吕加平，梁占东．乳酸菌增菌培养基的优化设计【Ｊ　Ｊ．中国乳品工　业，１９９９，２７（３）：１２—１５．　【４］ＡＢＲＡＮＨＡＮ　Ａ　Ｇ，ＡＮＴＯＮＩ　Ｇ　Ｌ，ＡＮＯＮ　Ｍ　Ｃ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃａｓ　ｇｒｏｗｎ　ｉｎ　ｍｉｌｋ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（ＵＳＡ），１９９３，７６（６）．　童　。０．６　０，４　０．２　Ｏ　３　０　【５】房兴利，晋津，酸奶生产液体发酵剂的研究【Ｊ】．中国乳品工业，　６　９　１２　１５　１８　２１　２４　１９９４，２２（５）：２０７—２０８．　ｔ／ｈ　【６１黄良昌，吕晓玲．保加利亚乳杆菌浓缩培养的研究【ｊ】．中国乳品　工业，２００２，３０（１）：１２—１６．　图３　保加利亚乳杆菌生长曲线　欢迎订阅　乳品与人类　邮发代号：ｌ４—２８４　《乳品与人类》是我国惟一以传播乳品科普知识，并融合于人类的生活、健康、饮食文化、人　土风情为一体的大型科普期刊。　该刊以科学饮食文化为理念，服务于所有追求健康生活的朋友。它针对全国不同阶层的消费群　体，全面展示乳品与人类生活相关的科普知识及消费指南，　ＯＬ品与人类》将连接着我们的生活，　生命、健康之源一同成长。　欢迎订阅欢迎投稿欢迎发布广告　全年定价：３０元　可直接汇款到《中国乳品工业》杂志社　邮编：１５００８６　地址：哈尔滨市南岗区学府路３３７号　联系电话：０４５１ｍ６６６２７４０　Ｖｏ１．３０，Ｎｏ．５　２００２（ｔｏｔａｌ　１５０）　☆