叶绿素的提取和叶绿素铜钠的合成于测定

叶绿素的提取和叶绿素铜钠的合成与测定

一. 实验目的和要求 1. 从蚕沙中提取叶绿素并计算提取率 2. 研究用叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件 3. 分析叶绿素铜钠产品的纯度、计算产率 二. 实验原理

叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，它与蛋白质结合存在于植物的叶绿素的也和绿色的茎中，是植物进行光合作用所必须的催化剂，叶绿素难溶于水，而易溶于极性有机溶剂。

叶绿素有a和b 两种，a为蓝黑色结晶

叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，在叶绿素的结构中，含有一个由四个吡咯环和四个次甲基交替相联形成的卟吩环．卟吩环闭合的共轭体系提供了包围镁离子(或其它相似离子)的刚性平面．

叶绿素的结构如图l所示：

蚕沙中含有丰富的叶绿素，其纯含量达0.8—1.0%，居所有天然色素之首，故可用蚕沙来提取叶绿素，由于叶绿素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶剂，故可用乙醇、丙酮混合液来提取。所得的叶绿素由于遇热、光、酸、碱等易分解，且又不溶于水。110度左右会分解，故把叶绿素制备成叶绿素铜钠，其性质更稳定溶解性也会有所提高。

叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，一个被四所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐：

Ｃ55Ｈ72Ｏ5Ｎ4Ｍｇ + 2ＮａＯＨ→Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4ＭｇＮａ2 + ＣＨ3ＯＨ + Ｃ20Ｈ39ＯＨ

Ｃ55Ｈ70Ｏ6Ｎ4Ｍｇ + 2ＮａＯＨ→ Ｃ34Ｈ28Ｏ6Ｎ4ＭｇＮａ2 + ＣＨ3ＯＨ + Ｃ20Ｈ39ＯＨ

在酸性条件下，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿酸：

Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4ＭｇＮａ2 + 4Ｈ+ = Ｃ34Ｈ34Ｏ5Ｎ4 + Ｍｇ2+ + 2Ｎａ+

+ 2+ +

Ｃ34Ｈ28Ｏ6Ｎ4ＭｇＮａ2 + 4Ｈ= Ｃ34Ｈ32Ｏ6Ｎ4 + Ｍｇ+ 2Ｎａ

叶绿酸可与铜盐在加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应生成叶绿素铜钠：

Ｃ34Ｈ34Ｏ5Ｎ4+Ｃｕ2+ = Ｃ34Ｈ32Ｏ5Ｎ4Ｃｕ+ 2Ｈ+ Ｃ34Ｈ32Ｏ6Ｎ4+Ｃｕ2+ = Ｃ34Ｈ30Ｏ6Ｎ4Ｃｕ+ 2Ｈ+

Ｃ34Ｈ32Ｏ5Ｎ4Ｃｕ + 2ＮａＯＨ = Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4CｕＮａ2 + 2Ｈ2Ｏ Ｃ34Ｈ30Ｏ6Ｎ4Ｃｕ + 2ＮａＯＨ = Ｃ34Ｈ28Ｏ6Ｎ4CｕＮａ2 + 2Ｈ2O 三. 仪器和试剂 （一）试剂：

蚕沙（50克） 95%乙醇 NaOH 溶液 稀盐酸 丙酮 石油醚 CuSO4 溶液 蒸馏水 40%乙醇 5%NaOH-乙醇溶液 pH试纸 磷酸盐缓冲液（pH=7.5） 取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以21：4混合 （二）仪器：

721型分光光度计，蒸馏装置,过滤装置,减压过滤装置,回流装置,分液漏斗装置，电子天平,电热恒温水浴锅及常用玻璃仪器等。

四. 实验步骤

蚕沙→浸取→过滤→浓缩→皂化→萃取→调酸→铜代→调酸→过滤→成盐→洗涤、干燥→产品

（一）叶绿素铜钠的合成 1. 叶绿素的提取：

（1）在500ml圆底烧瓶中，先加入50g干蚕沙，再加入95%乙醇100ml。 （2）将反应瓶用水浴加热，使水浴温度不超过80℃（防止叶绿素a和b分解），浸泡提取3小时，，滤出提取液。 （3）按步骤2用乙醇重复2次。

（4）合并3次提取液，在减压下蒸出乙醇。

趁热倾出瓶中液体，冷却至室温，得到墨绿色膏状物（叶绿素粗品，不宜久置）。 2. 皂化：

将浓缩液置于带搅拌子三口烧瓶中，用5%NaOH-C2H5OH溶液调节使其p H等于11，用水浴加热在60℃下皂化回流1-2小时。 3. 萃取：

将皂化液冷却后转入分液漏斗加入等量石油醚萃取除去杂质（黄色）静置分层，下层为可溶性叶绿酸盐（绿色），取下层溶液，上层溶液用旋转蒸发器蒸发回收石油醚。平行萃取3次。 4. 调酸铜代：

将下层溶液装入三口烧瓶中，往其中慢慢加入稀盐酸溶液调节pH值为7后，加入10%的硫酸铜2ml，搅拌均匀后，再用盐酸将溶液调节pH为2-3，在水浴60℃下保温搅拌1小时。

趁热过滤，滤渣先用水洗去，再用95%乙醇洗涤4次后抽干。合并滤液和洗液，加入等量的蒸馏水，析出叶绿素铜，静置4小时后过滤，滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇及石油醚洗涤3次至石油醚层变为浅绿色，以除去其中的H+ Cl及残留的叶黄素和其他有机杂质。 5. 成盐：

洗涤结束后滤干，滤饼用丙酮溶解，搅拌，成盐（用滤纸法检验成盐情况：用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不显绿色则说明完全成盐），将其在60℃下加热蒸发以除去水分得墨绿色结晶物，然后再在60℃下烘箱中烘干结晶物，即制得墨绿色光泽的成品（略有胺味）。 （二）叶绿素铜钠质量鉴定

1. PH：准确称取0.01（精确至0.0002克）g叶绿素铜钠溶于蒸馏水配制成1%溶液，用酸度计测其PH值。

2. 标准叶绿素铜钠盐的标准曲线

称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。准确取1mL溶液以pH7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，即为0.001%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm波长处测定吸光值（A），以缓冲液作空白对照。类似地配制0.0005%溶液、0.0015%溶液、0.002%溶液、0.0025%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm波长处测定它们的吸光值（A），以缓冲液作空白对照，并绘制标准曲线。

3. 标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线

称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。准确取1mL溶液以pH7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，即为0.001%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm， 吸光比A405nm/A630nm 为3.2～4.0。用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在350nm-700nm波长处测定溶液吸光值A（每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。

4. 产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定

称取烘干成品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。从容量瓶中准确取10mL溶液移入100mL容量瓶，用pH7.5磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即为0. 004%溶液，此液最大吸收峰为410nm与635nm。用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在350nm-700nm波长处测定溶液吸光值A（每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。

计算

吸光比=

AA410nm635nm

五、注意事项：

1、水浴加热时温度控制不宜加热过快； 2、减压蒸馏时对压力的要求不能过高； 3、保证浸润时间足够、提取完全； 4、实验操作的规范及安全问题。 六. 试验记录：

试验操作 称取蚕沙50.21g 试验现象 灰绿色颗粒 备注 粉碎呈粉末状 蚕沙要浸泡足够久 乙醇易挥发 加150ml95%乙醇溶液于600C回流蚕沙湿润有叶绿素被提1.5小时，重复两次，再把两次溶出，混合溶液为深绿色. 液合并 抽滤取溶液 滤液为墨绿色 回收的乙醇量比原来加入滤液于600C下,用旋转蒸发仪浓缩的量少，圆底烧瓶中得到至80ml左右，回收乙醇 浓缩液 将滤纸上的叶绿素溶解并在浓缩液中加5% NaOH-C2H5OH调节PH为溶液的实际pH=12.13 11，用水浴加热在60℃下皂化回流 0.5小时，, 0.5h后再重新测PH，再调节pH为11，再皂化了0.5h 调节pH不稳定 皂化后，并洗涤加HCl调，PH＝7加HCl得PH＝6.98加入硫叶绿素铜酸调加入硫酸铜溶液调PH＝2－3，60℃酸铜溶液PH=2.65，溶液节pH很不稳定 在搅拌条件下，反应1h左右 中现胶状墨绿色悬浮物 趁热过滤，滤渣先用水洗去，再用95%乙醇洗涤4次后抽干。合并滤液和洗液，加入等量的 馏水静置4小时后过滤。 滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇及石油醚洗涤3次 滤饼用丙酮溶解，加入5%NaOH-乙醇溶液，调节pH为11，60℃下加热蒸发，然后再在60℃下烘箱中烘干结晶物 得墨绿色物质 洗涤液呈黄绿色 叶绿素铜钠 固体溶解得绿色液体 烘干得墨绿色物质 得产品0.0521g

称取0.0102g产品溶于蒸 馏水配成1%溶液，测其pH值 pH为8.87

吸收曲线的绘制：称取样品质量m =0.0106g ，按步骤定容到100ml， 测得吸光度如下： 波长/nm 吸光度A 波长/nm 吸光度A 350 0.524 540 0.111 360 0.540 550 0.109 370 0.592 560 0.114 380 0.659 570 0.118 390 0.772 580 0.132 400 0.913 590 0.146 405 1.000 600 0.158 410 1.007 610 0.165 415 0.940 620 0.207 420 0.870 625 0.217 425 0.633 630 0.229 430 0.517 635 0.284 440 0.347 640 0.318 450 0.311 645 0.285 460 0.278 650 0.275 470 0.240 655 0.234 480 0.197 660 0.194 490 0.167 670 0.148 500 0.140 680 0.113 510 0.129 690 0.096 520 0.131 700 0.079 530 0.113 七、实验数据处理 样品吸收曲线如下：

波长—吸光度曲线1.2001.000吸光度0.8000.6000.4000.2000.000300350400450500550波长/nm600650700750

1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线

称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。准确取1mL溶液以pH7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，即为0.001%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm波长处测定吸光值（A），以缓冲液作空白对照。类似地配制0.0005%溶液、0.0015%溶液、0.002%溶液、0.0025%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm波长处测定它们的吸光值（A），以缓冲液作空白对照，并绘制标准曲线。

表1 叶绿素铜钠盐标准曲线的测定数据表（光波长405nm） 溶液百分数（%） A405

0.0005 0.291 0.0010 0.543

0.0015 0.771 0.0020 0.998 0.0025 1.150

叶绿素铜钠标准曲线1.41.21y = 434.6x + 0.0987吸光度A0.80.60.40.2000.00050.0010.00150.002叶绿素铜钠溶液质量浓度（%）0.00250.003

2.计算产率及产品纯度分析：

(1)浓度为1%的标准溶液的PH值为8.87 (2)计算产率

60℃烘干（恒重）所得产品质量m=0.0521g，

又因实验用干蚕沙质量m=50.21g，

故产率W =

0.052150.21×100% = 0.104%

(3) 纯度分析

可知产品的0. 004%溶液的A410=1.007;由叶绿素铜钠盐的标准曲线图可以知：

y = 434.6x + 0.0987

其中y为吸光度A，x为叶绿素铜钠盐在溶液中的百分含量。 故当A410nm=1.007时，百分含量：

x=

1.0070.0987434.6 = 0.0021%

100所以本次实验制备的产品纯度为η=

0.00210.004%=52.50%

1、吸光度：A410 =1.007 ，A635 =0.284 2、吸光比：A410/A635 =1.007/0.284 =3.546

九、结果分析与讨论

1、蚕沙不过粉碎，可能导致叶绿素溶解不过充分，加乙醇会流时，时间不能达到2~3小时因时间不过只能中途停止。

2、加入缓冲液调pH时，由于滴加速度控制不好，使pH超过12。皂化1小时后，用石油醚萃取，上层杂质还是有少许的绿色，可能是碱分解部分叶绿素了。 3、蒸发烘干结晶后，得到的结晶是粉末状而是比较薄的叶状，可能在之前的步骤中有些反应不够充分。

4、本次实验所得产品的纯度为52.50%，说明产品纯度一般。最主要还是干燥时不够完全，看起来产品都是粘状的，水分应该还有，所以称量得到的产品纯度本来就有限，最后的纯度当然也会有差别。 收利用。

5、实验中应注意：

萃取前，应取一些皂化液实验是否皂化出了叶绿素，如果出现明显的分层现象，说明已皂化完全，就可以加入适量石油醚进行萃取。否则要再调节pH值重新皂化。

整个实验最重要的操作是叶绿素的皂化和铜代，如果这两步做得不好，即皂化不完全或铜代不完全，所得的产品就不纯或产率降低。皂化过程要及时调节pH值，以保持在碱性条件下皂化，这样造化效果才会更好。

十、 实验收获

1.通过这两次综合实验，我学会了怎样设计和操作一个完整的实验，并学会了怎样书写一份完整的实验报告，实验试剂的配制也是自己计算之后自己配制出来的。学会了独立操作实验。在实验过程中，如不考虑周全，试剂的量不足或过量都回使整个实验失败而重做。同时在实验前应通过多渠道多方面的获取关于本次实验的资料，制定一个完整可行的实验方案是整个实验的关键，当然实验过程遇到问题也要及时变通解决，要不要离心的问题就是经过考虑讨论解决的。实验不能死板按照实验方案去做，实验过程还是发现方案有一些小错误，现在都改回来了。总之实验考虑的是综合的东西。

2.通过本次实验，对基本实验的操作有了更深一步的了解，对各种仪器的使用也有了进一步的认识。学会了独立思考问题，对于做不出来的现象，能自己找出原因，并进行验证，最终找出可行的办法。在提高自己的动手能力的同时也提高了

学习的兴趣。在操作仪器时，我用移液管的方法错误，得到老师纠正后果然是标准的方法比较容易控制。所以说还是要学会正确的仪器操作方法。

3. 实验过程要有环保意识，实验中的一些试剂可以回收利用的要回收利用，尽可能的减少环境的污染。有些有毒的试剂在操作过程中要格外小心，要注意保持实验的空气流通，避免中毒。同时有些试剂也要注意回收，配制试剂时也要算好用量，可以避免浪费。

4.在实验过程中要培养自己严谨的实验态度，要有足够的耐心。更重要的是打好基础，才能在实验是做到胸有成足。

5.我们在做实验前与生物班进行了充分的交流，所以我们的实验比较成功。这充分说明，实验要交流，要敢于试验。实验过程和实验后要善于总结，找出错误的原因以及一些改进方法。

6.这次实验学到了一些两年来该学的东西，虽然累了点，但收益真的挺大，开始了爱上实验的感觉，希望以后还有这样的机会。我觉得这应该是我们向正式专业课以及实验过渡的综合实验吧，算是巩固和升华。总之，这次实验学到挺多，也谢谢老师们的指导。

十一、参考文献：

1、于信令等.食品添加剂检验方法.第一版. 中国轻工业出版社，1992.10

2、刘成梅等.天然产物有效成分的分离与应用.第一版.化学工业出版社2003.1 3、王清槟等. 食品着色及及其分析方法.第一版 .化学工业出版社，2004.7 4、项斌等. 天然色素 第一版 化学工业出版社，2004.8 5、洪法水等. 应用化学 .第一版. 化学工业出版社，2001.7 6、周家华等. 食品添加剂 .第2版.化学工业出版社，2008.4 7、段玉峰等. 综合训练与设计.第一版. 科学出版社，2001.8 8、黄涛等. 有机化学实验.第二版. 高等教育出版社，1998.5