青蒿琥酯和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体对前列腺癌细胞凋亡的诱导作用

山东医药２０１２年第５２卷第２８期　青蒿琥酯和肿瘤坏死因子相关的　凋亡诱导配体对前列腺癌　细胞凋亡的诱导作用　张万玲　，袁红纲ｈ，江克华　。袁丁　（１三峡大学第一临床医学院，湖北宜昌４４３００３；２三峡大学医学院）　摘要：目的探讨青蒿琥酯和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（ＴＲＡＩＬ）诱导前列腺癌细胞（ＰＣ一３、ＬＮＣａＰ）　培养前列腺癌Ｐｃ一３、ＬＮＣａＰ细胞，分别加入青蒿琥酯和ＴＲＡＩＬ，随机分为４组，对照组、ＴＲＡＩＬ　促凋亡基因（ｃａｓｐａｓｅ．３／ｃａｓｐａｓｅ－８、Ｂａｘ、　凋亡的机制。方法组、青蒿琥酯组、ＴＲＡＩＬ＋青蒿琥酯组，分别采用ＲＴ—ＰＣＲ法和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测各组细胞内相关信号分子　（ｃａｓｐａｓｅ・３／ｃａｓｐａｓｅ一８、Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ、Ｂａｋ）在ｍＲＮＡ及蛋白水平的表达。结果ＴＲＡＩＬ及青蒿琥酯的浓度呈负相关。结论Ｂａｋ）ｍＲＮＡ及蛋白的表达与ＴＲＡＩＬ及青蒿琥酯的浓度呈正相关，凋亡抑制基因（Ｂｃ１．２）蛋白及ｍＲＮＡ的表达与　青蒿琥酯和ＴＲＡＩＬ诱导前列腺癌细胞（ＰＣ．３、ＬＮＣａＰ）凋亡的机制可能　是通过上调ｃａｓｐａｓｅ一３／ｃａｓｐａｓｅ一８、Ｂａｘ、Ｂａｋ等促凋亡基因和下调Ｂｃｌ－２等凋亡抑制基因来实现的。　关键词：青蒿琥酯；肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体；细胞培养；细胞凋亡　中图分类号：Ｒ７３７．２５　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１２）２８－００４０－０３　近年来研究发现，青蒿琥酯　和肿瘤坏死因子　司）。鼠抗人ｃａｓｐａｓｅ一３单克隆抗体，鼠抗人ｃａｓｐａｓｅ．　相关的凋亡诱导配体（ＴＲＡＩＬ）　均可诱导前列腺　８单克隆抗体，兔抗人Ｂｃ１－２单克隆抗体，鼠抗人　Ｂａｘ单克隆抗体均购于武汉博士德生物公司；鼠兔　癌细胞凋亡，但关于青蒿琥酯和ＴＲＡＩＬ对前列腺癌　细胞凋亡诱导作用的机制的研究还少见报道。２００９　年７月～２０１１年７月，本实验选择雄激素非依赖性　前列腺癌细胞株ＰＣ３和雄激素依赖性细胞株ＬＮ．　抗人Ｂａｋ单克隆抗体１：２００　Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司（ＵＳＡ）；　ＲＩＰＡ蛋白裂解液（强）、预染蛋白分子量标准、ＥＣＬ　化学发光试剂盒（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司）；ＰＶＤＦ膜、垂直蛋　ＣａＰ为研究对象，观察不同浓度青蒿琥酯和ＴＲＡＩＬ　对前列腺癌细胞凋亡的影响，分别采用ＲＴ．ＰＣＲ法　白电泳仪、半干电转仪（Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司产品）。　１．２方法　１．２．１细胞培养与分组人前列腺癌ＰＣ一３细胞及　ＬＮＣａＰ细胞均培养于含１０％小牛血清（杭州四季　青）的ＲＰＭＩ　１６４０培养基（Ｇｉｂｃｏ）中，添加１００　Ｕ／ｍＬ　青霉素及１００　Ｕ／ｍＬ链霉素，３７　ｏＣ　５％ＣＯ　条件下　和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测细胞内相关信号分子　（ｃａｓｐａｓｅ－３／ｃａｓｐａｓｅ一８、Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ、Ｂａｋ）ｍＲＮＡ和蛋白　的表达。探讨青蒿琥酯和ＴＲＡＩＬ对前列腺癌细胞　凋亡诱导作用的机制，以期为临床使用青蒿琥酯和　ＴＲＡＩＬ治疗前列腺癌提供理论依据。　１材料与方法　常规培养，取指数生长期约５×１０　／ｍＬ细胞传代并　接种于２４孔板中，培养１２　ｈ后加入不同浓度青蒿　琥酯及ＴＲＡＩＬ蛋白。随机分为４组，对照组、ＴＲＡＩＬ　组（１　ｎｇ／ｍＬ）、青蒿琥酯组（１　ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＴＲＡＩＬ（１　ｎｇ／ｍＬ）＋青蒿琥酯（１　ｍｍｏｌ／Ｌ）组。　１．１材料青蒿琥酯注射液，购自桂林南药股份有　限公司（批号０３０８０１），人前列腺癌ＰＣ－３细胞株购　自中国典型物培养中心（ＣＴＣＣ），人前列腺癌ＬＮ．　ＣａＰ细胞由华中科技大学同济医学院泌尿外科实验　室惠赠，碘化丙锭（ＰＩ）购自华美生物工程公司。　ＴＲＩｚｏｌ总抽提试剂盒（美国Ｓｉｇｍａ公司），ＲＴ—ＰＣＲ试　剂盒及ｑＰＣＲｍｉｘ（ＴａＫａＲａ宝生物工程大连有限公　１．２．２　ＲＴ—ＰＣＲ法检测细胞内相关信号分子ｍＲＮＡ　的表达　根据ＧｅｎｅＢａｎｋ提供的人类ｃａｓｐａｓｅ．３／　ｃａｓｐａｓｅ－８、Ｂｃ１－２、Ｂａｘ、ＢａｋｍＲＮＡ序列（Ｕ２０７７０１），使　用Ｐｒｉｍｅ５．０软件设计引物序列，ｃａｓｐａｓｅ一３：５　．ＣＡＴ—　ＧＧＣＣＴＧＴＣＡＧＡＡＡＡＴＡＣ一３　．５　一ＴＡＡＣＣＣＧＡＣＴＡＡＧ－　ＡＡＴＧＴＧＣ－３　，１７６　ｂｐ；ｃａｓｐａｓｅ－８：５　一ＧＧＧＡＡＧＴ—　ＧｑＴＩｑ＇ＣＡＣＡＧＧＴＩ＂一３　．５　一　ＩＴＣＴＴＧＣ　ＩＴＣＣＴ丌ＧＣＧＧＡ—　ＡＴ一３　，３７９　ｂｐ；Ｂａｘ：５　．ＣＡＴＣＣＡＧＧＡＴＣＧＡＧＣＡＧＡ．　基金项目：湖北省宜昌市２００８年医疗卫生科技计划项目（Ａ０８３０２—　４７）。　｝通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｕａｎｈｏｎｇｇａｎｇ２００３＠ｓｉｎａ．ｔｏｍ　４０　山东医药２０１２年第５２卷第２８期　３　，５　－ＧＣＣＴＩ＂ＧＡＧＣＡＣＣＡＧｒｒＩ’ｒＧ一３　，２８２　ｂｐ；Ｂａｋ：５　一　ＴＧＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＩ＇ＣＧＧＧＧＣＡＡＧＧＣ－３　．５　一ＴＣＡＴＧＡ—　基因（ｃａｓｐａｓｅ－３／ｅａｓｐａｓｅ－８、Ｂａｘ、Ｂａｋ）ｍＲＮＡ的表达　随着青蒿琥酯及ＴＲＡＩＬ剂量的增加而增大，具有良　好的量效关系；凋亡抑制基因（Ｂｃ１－２）ｍＲＮＡ的表达　ＴｒｒＧＡＡＧＡＡＴＣＴＴＣＧＴＡＣＣ一３　，６４２　ｂｐ；Ｂｃｌ－２：５　一　ＡＧＡＡＴＧＣＴＴＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＣ－３　．５　－ＴＹＧＡＴＩ＇ＡＧＡ—　ＧＡＡＴＣＴＹＣＧＴＡＣＣ一３　．５２６　ｂｐ：ＧＡＰＤＨ：５　－ＣＡＴＧＣ—　随着青蒿琥酯及ＴＲＡＩＬ剂量的增加而减少。促凋　亡基因（ｃａｓｐａｓｅ一３／ｃａｓｐａｓｅ－８、Ｂａｘ、Ｂａｋ）ｍＲＮＡ的表　ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＹＣＣＣＧＴＩ＂－３　，５　一ＧＴＧＧＡＧＴＣＴＡＣＴＧＧＣ—　ＧＴＣＴＹＣ一３，４０８　ｂｐ。采用ＴＲＩｚｏｌ试剂一步法提取组　织总ＲＮＡ，按ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒说明书进行操作。　ＰＣＲ扩增，取ＰＣＲ产物５　在８０　Ｖ电压和２％的　琼脂糖凝胶电泳中电泳，ＵＶＰ凝胶成像系统照相扫　描，测定标本的灰度值，计算出每个标本灰度值和　ＧＡＰＤＨ灰度值的比值来判断各组中ｍＲＮＡ表达的　相对表达含量。　１．２．３　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测细胞内相关信号分子蛋　白的表达提取细胞总蛋白，提蛋白前将ＰＭＳＦ　１０　Ｌ加入１　ｍＬ蛋白裂解液ＲＩＰＡ，取细胞约１×１０　个加入ＲＩＰＡ，冰上裂解３０　ｍｉｎ，１０　０００　ｇ离心１Ｏ　ｍｉｎ，取上清。采用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓　度，酶标仪测定波长为Ａ５６２，根据标准曲线计算出　蛋白浓度。灌制１０％的分离胶、５％浓缩胶的ＳＤＳ．　ＰＡＧＥ凝胶。吸取６０　ｇ总蛋白，恒压８０　Ｖ，３０　ｍｉｎ。　当溴酚蓝前沿进入分离胶，把电压提高到１２０　Ｖ，继　续电泳９０　ｍｉｎ直到溴酚蓝到达分离胶底部。半干　电转恒压２０　Ｖ，１８　ｍｉｎ，将蛋白从ＳＤＳ．ＰＡＧＥ凝胶转　至ＰＶＤＦ膜。将凝胶上的蛋白电转移至ＮＣ膜，以　５％脱脂奶粉４℃封闭过夜，分别加一抗（鼠抗人　ｃａｓｐａｓｅ．３单克隆抗体１：２５０，鼠抗人ｃａｓｐａｓｅ一一一８单克　隆抗体１：１００，兔抗人Ｂｃ１．２单克隆抗体１：５０，鼠抗　人Ｂａｘ单克隆抗体１：２５０，鼠兔抗人Ｂａｋ单克隆抗　体１：２００），３７℃孵育２　ｈ，０．１％ＴＢＳＴ液漂洗ＰＶＤＦ　一一膜３次×１０　ｍｉｎ，取出ＰＶＤＦ膜加入二抗（辣根过氧　化物酶标记的兔抗鼠二抗１：５　０００，羊抗兔二抗１：　４　０００），３７　ｏＣ孵育２　ｈ。ＴＢＳＴ洗膜后加入ＥＣＬ试剂　显影。ＵＶＩ凝胶成像系统摄像，Ｉｍａｇｅ　Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ　５．０　软件分析条带灰度值，计算出每个标本灰度值和Ｂ—　ａｃｔｉｎ灰度值的比值来判断各组中蛋白表达的相对　表达含量。　１．２．４统计学方法采用ＳＰＳＳ１２．０统计软件进行　处理，数据均以　±Ｓ表示，采用ｔ检验，以Ｐ≤０．０５　为有统计学差异。　２结果　２．１　ＲＴ—ＰＣＲ试验结果各种信号分子ｍＲＮＡ在　ＰＣ一３（图１）及ＬＮＣａＰ（图２）细胞中的表达，除ＰＣ．３　细胞中Ｂａｋ在ＴＲＡＩＬ组表达（Ｐ＞０．０５）以外，各组　与对照组比较均有统计学差异（Ｐ＜０．０１）；促凋亡　达与ＴＲＡＩＬ及青蒿琥酯的浓度呈正相关，凋亡抑制　基因（Ｂｃ１．２）ｍＲＮＡ的表达与ＴＲＡＩＬ及青蒿琥酯的　浓度呈负相关。　１　２　３　４　ｃａｓｐａｓｅ一３　ｃａｓｐａｓｅ一８　Ｂａｘ　Ｂａｋ　Ｂｃｌ一２　ＧＡＰＤＨ　图１各种信号分子ｍＲＮＡ在ＰＣ－３中表达　注：１为对照组；２为ＴＲＡＩＬ组；３为青蒿琥酯组；４为ＴＲＡＩＬ＋　青蒿琥酯组　∞　吩　印　ｌ　２　３　４　一　一　盼　髓　ａ　Ｂｃｌ一２　一一　一ＧＡＰＤＨ　图２各种信号分子ｍＲＮＡ在ＬＮＣａＰ中表达　注：Ｉ为对照组；２为ＴＲＡＩＬ组；一３为青蒿琥酯组；４为ＴＲＡＩＬ＋　青蒿琥酯组　２．２　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果各种信号分子蛋白在ＰＣ．一一一一　３　（图３）及ＬＮＣａＰ（图４）细胞中的表达，各组与对照　组比较均有统计学差异（Ｐ＜０．０１）；促凋亡基因　（ｃａｓｐａｓｅ一３／ｃａｓｐａｓｅ一８、Ｂａｘ、Ｂａｋ）蛋白的表达随着青　蒿琥酯及ＴＲＡＩＬ剂量的增加而增大；凋亡抑制基因　（Ｂｃｌ－２）蛋白的表达随着青蒿琥酯及ＴＲＡＩＬ剂量的　增加而减少。促凋亡基因（ｃａｓｐａｓｅ一３／ｃａｓｐａｓｅ一８、　Ｂａｘ、Ｂａｋ）蛋白的表达与ＴＲＡＩＬ及青蒿琥酯的浓度　呈正相关，凋亡抑制基因（Ｂｅｌ－２）蛋白的表达与　ＴＲＡＩＬ及青蒿琥酯的浓度呈负相关。　３讨论　目前对前列癌的治疗措施包括手术治疗和药物　治疗。由于前列腺癌主要发生于老年男性患者，且　易发生骨转移，因此手术治疗具有很大的局　限性　Ｊ。而前列腺癌经雄激素抑制药物治疗一段时　４１　山东医药２０１２年第５２卷第２８期　的表达与ＴＲＡＩＬ及青蒿琥酯的浓度呈负相关。由　ｃａｓｐａｓｅ一３　此可见，青蒿琥酯和ＴＲＡＩＬ诱导前列腺癌细胞（ＰＣ一　３、ＬＮＣａＰ）凋亡的机制可能是通过上调ｃａｓｐａｓｅ．３／　ｃａｓｐａｓｅ一８、Ｂａｘ、Ｂａｋ等促凋亡基因和下调Ｂｃｌ－２等凋　ｃａｓｐａｓｅ一８　Ｂａｘ　３　８　Ｘ哪　哪　一５ａ｝　一　ａ　　　Ｂ　ｋ　２　Ｂ　　ｍ：星一　亡抑制基因来实现的。并且，青蒿琥酯与ＴＲＡＩＬ联　Ｂａｋ　Ｂｃｌ－２　ｐ－ａｃｔｉｎ　图３　ＰＣ－３细胞中各种信号分子蛋白含量的表达　注：ｌ为对照组；２为ＴＲＡＩＬ组；３为青蒿琥酯组；４为ＴＲＡＩＬ＋　青蒿琥酯组　一一一一一１　一２　　一３　４　一一图４　ＬＮＣａＰ细胞中各种信号分子蛋白含量的表达　注：Ｉ为对照组；２为ＴＲＡＩＬ组；３为青蒿琥酯组；４为ＴＲＡＩＬ＋　青蒿琥酯组　问后，可能会转化为激素非依赖性肿瘤，雄激素抑制　疗法就失去了治疗作用¨　。虽然对抑制前列腺癌　的药物研究已做了大量工作，但目前对激素非依赖　性前列腺癌仍缺乏有效的药物治疗措施　ｌ　。因此，　研究新的疗效确切、副作用较小的抗前列腺癌新药　仍是目前研究的主要任务。　青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，具有显著的抗疟　疾作用。近期研究发现，青蒿素及其衍生物对多种　肿瘤细胞均有一定的抑制作用　；青蒿素抗肿瘤的　作用机制，研究提示可能是通过抑制细胞增殖和诱　导肿瘤细胞凋亡来实现的　。近年来研究发现，青　蒿琥酯　和ＴＲＡＩＬｌ５　均可诱导前列腺癌细胞凋亡，　但关于青蒿琥酯和ＴＲＡＩＬ对前列腺癌细胞凋亡诱　导作用的机制的研究还少见报道。本实验选择雄激　素非依赖性前列腺癌细胞株ＰＣ３和雄激素依赖性　细胞株ＬＮＣａＰ为研究对象，观察不同浓度青蒿琥酯　和ＴＲＡＩＬ对前列腺癌细胞凋亡的影响，并用ＲＴ—　ＰＣＲ检测细胞内相关信号分子（ｃａｓｐａｓｅ一３／ｃａｓｐａｓｅ一　８、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｂａｋ）ｍＲＮＡ表达。探讨青蒿琥酯和　ＴＲＡＩＬ对前列腺癌细胞凋亡诱导作用的机制，以期　为临床使用青蒿琥酯和ＴＲＡＩＬ治疗前列腺癌提供　理论依据。本研究发现，促凋亡基因（ｃａｓｐａｓｅ－３／　ｃａｓｐａｓｅ．８、Ｂａｘ、Ｂａｋ）ｍＲＮＡ的表达与ＴＲＡＩＬ及青蒿　琥酯的浓度呈正相关，凋亡抑制基因（Ｂｃｌ－２）ｍＲＮＡ　４２　合使用对前列腺癌存在诱导凋亡的协同作用。青蒿　琥酯可以增加ＴＲＡＩＬ对前列腺癌细胞的敏感性，可　能可以逆转耐药细胞株对ＴＲＡＩＬ的敏感性。青蒿　琥酯与ＴＲＡＩＬ联合使用对前列腺癌存在诱导凋亡　的协同作用。青蒿琥酯能诱导提高前列腺癌细胞对　ＴＲＡＩＬ的敏感性，加强ＴＲＡＩＬ的诱导肿瘤细胞凋亡　的作用。青蒿琥酯可以增强ＴＲＡＩＬ对前列腺癌细　胞的杀伤效应，效果优于两种药物单独使用。青蒿　琥酯有望成为新的疗效确切、副作用较小的抗前列　腺癌新药，具有良好的市场前景。一一　　本实验为青蒿琥酯用于前列腺癌的治疗提供了　实验依据，为将青蒿琥酯作为抗肿瘤药物运用于临　床奠定了实验基础。　参考文献：　［１］张晓艳，王新华．青蒿的传统应用与青蒿素的现代研究［Ｊ］．中　华医药杂志，２００４，５（１）：２３－２４．　［２］Ｔｈｏｍａｓ　Ｇ，Ｍａｒｉａ—Ｅｍｉｌｙ　Ｇ，Ｄｅｍｅｔｒｉｏｓ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｌ／ＮＦ—ｋＢ／ＩｋＢ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃａｎｃｅｒ　［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｍ，２００２，１８１（１）：１－９．　［３］Ａｌｄｉｅｒｉ　Ｅ，Ａｔｒａｇｅｎｅ　Ｄ，Ｂｅｒｇａｎｄｉ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｉｎ—　ｄｕｃｉｂｌｅ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ＮＦ—ｋＢ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　［Ｊ］．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００３，５５２（２－３）：１４１—１４４．　［４］祝瑾，李宁川，程宏．ＴＲＡＩＬ诱导白血病细胞凋亡的分子机制研　究［Ｊ］．实用临床医药杂志，２００４，８（３）：３６－４０．　［５］陈江，陈晓春，曾甫清．ＴＲＡＩＬ抑制人前列腺癌细胞ＰＣ－３Ｍ体外　生长的实验研究［Ｊ］．肿瘤防治研究，２００４，３１（７）：３９５．３９７．　［６］Ｈｅｓｒｙ　Ｖ，Ｐｉｑｕｅｔ－Ｐｅｌｌｏｒｃｅ　Ｃ，Ｔｒａｖｅｒｔ　Ｍ，ｅｔ　１ａ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ＴＲＡＩＬ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ：　ＤＲ５　ａｎｄ　ｃａｓｐａｓｅ　８　ａｒｅ　ｋｅｙ　ｐｌａｙｅｒｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｓｔａｔｅ，２００６，６６（９）：　９８７－９９５．　［７］Ｍｕｎｓｈｉ　Ａ，Ｐａｐｐａｓ　Ｇ，Ｈｏｎｄａ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．ＴＲＡＩＬ（ＡＰＯ－２Ｌ）ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔａｂｌｅ　ｂｙ　Ｂｃｌ－２　［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１，２０（２９）：３７５７－３７６５．　［８］袁丁，张长城．青蒿琥酯对前列腺癌ＰＣ３细胞的抑制作用［Ｊ］．　中国医院药学杂志，２００７，２７（８）：１０４９—１０５１．　［９］Ｃａｏ　Ｄ，ＨａｆｅｚＭ，ＢｅｒｇＫ，ｅｔ　ａ１．Ｌｉｔｔｌｅ　ｏｒｎｏ　ｒｅｓｉｄｕａｌ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｎｃｅｒ　ａｔ　ｒａｄｉｃａｌ　ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ：ｖａｎｉｓｈｉｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｏｒ　ｓｗｉｔｃｈｅｄ　ｓｐｅｃｉｍｅｎ？：ａ　ｍｉｃ－　ｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　０ｆ　ｓｐｅｃｉ￣ｎ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｐａｔｈｏｌ，２００５，　２９（４）：４６７－４７３．　［１０］ＮａｓｕＹ，Ａｂｚｒｚｕａ　Ｆ，ＫｕｍｏｎＨ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｎｃｅｒ　ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．　Ｎｉｐｐｏｎ　Ｒｉｎｓｈｏ，２００５，６３（Ｓｕｐｐｌ　１２）：５４４－５４７．　（１１］Ｓｉｎｇｈ　ＮＰ，Ｌａｉ　ＨＣ．Ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００４，２４（４）：２２７７－２２８０．　（收稿日期：２０１１—１１—１５）　一