冬虫夏草中虫草素相关基因的克隆及生物信息学分析

交通医学 2019 年第 33 卷第 3 期Med J of Communications,2019,Vol.33.No.3

[文章编号] 1006-2440[2019]03-0222-04

冬虫夏草中虫草素相关基因的克隆及生物信息学分析*

吴娟娟1,2**，吴明月2，贾　惠2，张　森2，朱蕙霞2

2

（1南通大学杏林学院；南通大学医学院，江苏 226001）

[摘　要]　目的：虫草素是冬虫夏草和蛹虫草的有效成份之一，根据野生型虫草菌的虫草素相关基因片段，利用PCR技术在冬虫夏草中扩增获取相似基因片段。方法：根据已公开专利报道的野生型虫草菌的虫草素相关基因片段，设计引物在冬虫夏草DNA中PCR扩增目的序列，测序并用生物信息学分析相关片段。结果：在冬虫夏草的DNA中利用PCR扩增到一条613 bp虫草素相关基因片段，与NCBI基因数据库比对显示，与蛹虫草的中ATCC34164序列相似性达到96%。利用ORF Finder共查询到6个ORF片段，其中最大的为294 bp；利用ProtScale分析最大ORF序列翻译成的蛋白质，发现该翻译蛋白质为亲水性蛋白；利用TMpred预测到该翻译蛋白质存在2种跨膜模型，推荐相对膜的取向由内到外，N端处在膜外。结论：本研究为冬虫夏草中虫草素相关基因功能的后续研究提供了可靠基础数据。

[关键词]　冬虫夏草；虫草素；分子技术；生物信息学

[中图分类号]　R915　　　　[文献标识码]　A　　　　[DOI]　10.19767/j.cnki.32-1412.2019.03.003

Cloning and bioinformatics analysis of Cordycepin-related genes in Cordyceps sinensis

WU Juanjuan1,2, WU Mingyue2, JIA Hui2, ZHANG Sen2, ZHU Huixia2

(1Xinglin College of Nantong University; 2Medical School of Nantong University, Jiangsu 226001)

[Abstract]　Objective: Cordycepin is one of the effective components of Cordyceps sinensis and Cordyceps militaris, and plays an important role in antimicrobial and anti-tumor activities. According to the reported cordycepin-related gene fragments of wild-type Cordyceps sinensis, a similar gene fragment was amplified by PCR in Cordyceps sinensis. Methods: According to the cordycepin-related gene fragments of wild-type Cordyceps sinensis reported in public patents, the primers were designed to amplify the target sequence in Cordyceps sinensis DNA by PCR, and the fragments were sequenced and analyzed by bioinformatics. Results: A 613 bp gene fragment was amplified by PCR in the DNA of Cordyceps sinensis, and the alignment with the NCBI gene database showed that the similarity between the fragment and ATCC34164 in Cordyceps militaris reached 96%. Six ORF fragments were found by ORF Finder, the largest of which was 294 bp. The protein translated from the largest ORF sequence was analyzed by ProtScale and found to be a hydrophilic protein; Two transmembrane models of the translated protein were predicted by TMpred. The model suggests that the orientation of the relative membrane is from the inside to the outside, and the N-end is outside the membrane. Conclusion: This study provides reliable basic data for the follow-up study on the function of cordycepin-related genes in Cordyceps sinensis.

[Key words]　cordyceps sinensis; cordycepin; molecular technology;bioinformatics

虫草素(cordycepin)又名3'-脱氧腺苷(3-deoxy-adenosine)，是冬虫夏草中的主要活性成分，具有调节免疫、降脂、抗肿瘤、抗炎及抗氧化性等作用。虫草素辅助治疗恶性肿瘤的临床症状改善率达91.7％以上，起效速度快，不良反应极小[1-3]。但是近年来冬虫夏草由于过度采挖面临资源枯竭，且虫草素在冬虫夏草

中的含量较低，患者通过食用冬虫夏草获取治病剂量的虫草素成本很高。目前虫草素大多从蛹虫草中提取获得[4]，相关研究多集中于蛹虫草中的虫草素。由于冬虫夏草中虫草素的生物合成途径尚不明确，相关基因的研究较少，如果能克隆得到合成虫草素的相关基因，采用基因工程方法使虫草素合成相关基因高表

* [基金项目] 南通大学杏林学院科研基金（2016K137）。

** [作者简介] 吴娟娟，女，汉族，安徽淮南人，生于1979年7月，博士，副教授。研究方向：基因工程。

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达，构建基因工程菌，就可以大幅提高虫草素产量，用于临床治疗。本文根据已公开专利报道的野生型虫草菌的虫草素合成相关基因片段，根据相同功能的基因在亲缘关系较近的材料中具有保守性，设计引物在冬虫夏草DNA中PCR扩增获得一条613 bp片段，并用生物信息学分析相关片段，为虫草素合成的相关基因克隆和功能研究提供可靠的基础数据。1　材料与方法

1.1　材料　冬虫夏草[Cordyceps sinensis （Berk） Sacc]，植物基因组DNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒（TIANGEN），克隆相关酶、DNA Maker DL2000和pGEM-T载体（TaKaRa），感受态细胞DH5α（博迈德生物），引物合成和测序由invitrogen公司提供。其他试剂均为国产分析纯。1.2　方法

1.2.1　基因组提取与检测：参照植物基因组DNA提取剂盒的方法，并加以优化。提取的基因组DNA在1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量。

1.2.2　PCR反应体系构建：1.2 μL MgCl2（25 mmol/L），2 μL dNTP Mix（2.0 mmol/L），5 μM正、反向引物各2 μL，2 μLDNA模板，0.3 μL Taq酶（5 U/μL），2 μL 10×PCR buffer，加无菌水至25 μL。扩增程

M

M：分子量marker DL2000，每条带200 bp，

PCR产物613 bp.

　　图1　PCR扩增结果　　　　　　　　　　　　　　　　　　　图2.2　扩增基因的生物信息学分析

2.2.1　开放阅读框（ORF）分析：用在线软件ORF

序：95℃预变性2 min；94℃ 30 s，50℃30 s，72℃1 min，30个循环；72℃延伸8 min。引物：ChCS7-F：TACAAACGTACAACATGCTCCTTAC，ChCS7-R： AC-GTAGCAGAATAACTAGTGGGAAT。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，克隆到pGEM-T载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆并测序。

1.2.3　生物信息学分析：序列分析采用NCBI网站上BLASTn程序进行序列搜索比对。开放阅读框（ORF）用在线软件ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析。蛋白疏水性分析在线程序ProtScale）进行。跨膜结构域预测和分析用在线软件TMpredhtml）进行。2　结　果

2.1　虫草素相关基因的克隆　由于相同功能的基因在亲缘关系较近的材料中具有保守性，根据虫草菌已报道的虫草素相关序列设计引物，在冬虫夏草DNA中PCR扩增得到一条613 bp的片段（图1），invitrogen公司测序后，提交NCBI数据库比对，结果显示与甲基化转移酶家族有关（图2）。

2　BLASTn比对结果

Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）共查询到6个ORF片段，其中最大的为294 bp（图3）。

（西藏惠康堂）（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl（https://embnet. vital-it.ch/software/TMPRED_form.· 224 ·

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图3　ORF Finder预测结果

2.2.2　疏水性分析：蛋白质疏水和亲水作用是所含亲水性氨基酸和疏水氨基酸之间相互作用的结果，疏水性对蛋白质的稳定性、构象和蛋白质功能具有重大意义。将基因序列最大ORF序列翻译成蛋白质，利用Ex PASy数据库在线程序ProtScale分析该序列的亲水、

　　　　　　横坐标为氨基酸位置，纵坐标为亲疏水性得分　　　　　　横坐标为氨基酸位置，　　　　　　图4　ProtScale预测和分析蛋白质的亲疏水性　　　　　　　图译出来的蛋白质为亲水性蛋白。

2.2.3　跨膜结构域预测和分析：预测和分析跨膜结构域，对认识蛋白质的结构和功能有重要意义[6]。利用TMpred在线软件分析所获序列的翻译蛋白跨膜结构和在膜上的取向，结果见图5。该软件预测得分超过500的区域为可能的跨膜螺旋区域，符合该条件的区域为17~33aa；预测存在2种跨膜模型，强烈推荐模型是相对膜的取向由内到外，N端处在膜外（分值17 466）。3　讨　论

近年来研究发现虫草素具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、免疫调节等药理作用[3]，具有很高的经济价值，相关研究多集中于利用液体发酵方式提高虫草素产量和在蛹虫草中克隆虫草素相关基因。例如莫红丽等[7]采用抑制差减杂交方法（SSH）拟定6个可能与虫草素合成相关的基因。王文婷[2]以蝙蝠蛾拟青霉菌）作为实验菌种，对虫草素的代谢途径进行了探究。直接在冬虫夏草中克隆虫草素相

疏水性。结果见图4，其中第54位的缬氨酸（Val）疏水性最强（2.178），第8位的色氨酸（Trp）亲水性最强）。亲、疏水性分别用负值、正值表示。负值越小表示亲水性越强，正值越大表示疏水性越强，介于+0.5到-0.5之间主要为两性氨基酸[5]，

综合判断：该序列翻纵坐标为跨膜结构域得分

5　TMpred预测和分析蛋白质的跨膜结构域

关基因的研究较少。

本文以相同功能的基因在亲缘关系较近的材料中具有保守性为理论依据，根据已报道的草菌中虫草素相关基因片段为模板设计引物，第一次在冬虫夏草DNA中扩增出一条613 bp虫草素相关基因片段，该序列可能与冬虫夏草中虫草素的合成相关。生物信息学分析相关片段，与NCBI基因数据库比对显示与蛹虫草的中ATCC34164序列相似性达到96%。ORF Finder显示该序列共有6个ORF片段，其中最大的为294 bp；ProtScale分析最大ORF序列翻译成的蛋白质，显示该翻译蛋白质为亲水性蛋白；TMpred预测到该翻译蛋白质存在2种跨膜模型，强烈推荐相对膜的取向为由内到外，N端处在膜外。这些分析结果为进一步研究冬虫夏草中虫草素相关基因的功能提供了实验基础。该基因的全长克隆和蛋白表达实验正在进行中，后续有可能得到合成虫草素关键酶基因的亲水性蛋白，阐明虫草素合成的具体过程。随着对冬虫夏草中虫草素合成相关基因研究的不断深入，未来将在很大程度上促进虫草素的

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（Paecilomyces hepiali交通医学 2019 年第 33 卷第 3 期Med J of Communications,2019,Vol.33.No.3

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[收稿日期] 2019-01-18

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[收稿日期] 2018-11-19