血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验探讨

齐齐哈尔医学院学报２０１５年第３６卷第１５期Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｉｑｉｈａｒ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５．Ｖ０１．３６．Ｎ０．１５　・２２７１・　．技术・方法．　血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验探讨　王晓琴侯艳香　在相同的电泳条件下，牛血清醋酸纤维薄膜电泳同人血清醋酸纤维薄膜电泳结果相　参考人血清醋酸纤维薄膜电泳的方法。结果用小牛血清做醋酸纤　用小牛血清代替人血清做醋酸纤维　【摘要】　目的同，能得到清晰的５条区带。方法维薄膜电泳实验，各组分同人血清相同，含量稳定，重复性好。结论薄膜电泳，可以用于学生实验和临床研究。　【关键词】小牛血清；醋酸纤维薄膜；　电泳　电泳技术是重要的生物化学技术之一，血清蛋白醋酸纤　维薄膜电泳作为一项基本技术，已经成为各层次的医学生必　开的实验课。近几年来，我实验室经过不断的探索，取得了良　好的效果。　一后，用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸紧　贴在膜支架上　Ｊ，即为滤纸桥，是联系醋酸纤维薄膜和缓冲　液之间的桥梁）。用无齿镊子将点好样的薄膜平贴在电泳槽　支架的阴极端（点样面向下，加样线不能放在滤纸桥上，要距　桥垫约３ｍｍ）另一端平贴在阳极端。要求薄膜紧贴滤纸并悬　空绷直，中间不能下垂，薄膜与滤纸条之间不能留有气泡　Ｊ。　因为是学生实验，一个电泳槽里要放置很多膜条，所以膜条间　要有一定的间隔，以免相互干扰。用导线将电泳槽与电泳仪　连接好。盖严电泳室平衡５　ｍｉｎ后，方可通电。经过反复的　比较，我实验室采用在室温下，电压１００～１１０　ｖ，冬天电泳时　间５０　ａｉｒｎ，夏天电泳时间４０　ｍｉｎ。（４）染色：电泳完成后，用无　、材料和方法　１．仪器和试剂：电泳仪（稳压器，电泳槽），７２２型分光光　度计，盖玻片，载玻片，血清，醋酸纤维薄膜（２ｃｍ×８ｃｍ），滤　纸，巴比妥缓冲液（ｐＨ＝８．６），丽春红染液，２．５％冰醋酸漂　洗液，透明液（无水乙醇：冰醋酸＝７：３）（临用前配制），洗脱　液：０．４　ｍｏｔ／１ＮａＯＨ溶液。　２．方法：（１）醋酸纤维薄膜的浸泡：取一片薄膜，平放在　盛有缓冲液的平皿中，自然下沉。要求浸泡的薄膜在１５～３０　秒内迅速润湿，如膜条吸水不均匀，有白色斑点或条纹，应弃　齿镊子取出薄膜，染色５　ｍｉｎ。薄膜必须一张一张地投入到丽　春红染液中，染色固定前薄膜之间不能重叠，否则血清蛋白粘　连，影响分离效果。用新配制的丽春红染液与陈旧的丽春红　染液就染色效果作对比，发现新配制的染液染色效果浅淡，不　易着色，原因为丽春红颗粒大，不易溶解。经过实验，在配制　之前用研钵研磨成细粉末状，再按常规方法进行配制，用棕色　试剂瓶避光密封保存，数周后使用　。（５）脱色：染色完成　后，开始脱色，只需准备３杯漂洗液，将薄膜依次放入，每次飘　洗５　ｍｉｎ，直到背景无色，即达到漂洗的目的。漂洗液要求新　鲜配制，以防止挥发　Ｊ。（６）透明：将脱色后的薄膜平铺于载　玻片上，用玻璃棒将其间的气泡赶走，注意两者之间不能有气　泡。用胶头滴管取透明液少许滴加于薄膜表面，几分钟后薄　膜完全透明，放置其自然干燥。完全干后，再压一片载玻片于　薄膜上。此薄膜可作为教学标本长期保存。（７）定量：未经　去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界限不清。整条薄膜色泽　深浅一致，方可使用。薄膜浸泡时间不能低于２０分钟，但也　不能超过６小时。因为过短不能浸透，过长薄膜结构破坏…。　（２）点样：用无齿镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸　取多余的水分，以不干不湿为宜（缓冲液太多易引起样品扩　散，吸得太干则样品不易进入薄膜的网孔内，影响分离效果）　无光泽面向上，平放，在薄膜一端１．５　ｃｍ处点样。点样时，用　滴管吸取血清于载玻片上，用盖玻片的光滑一边做点样器，盖　玻片的两边脚扳去２～４　ｍｌＴｌ（因为薄膜和盖玻片的宽度都是　２　ｃｍ，扳去２～４　ｍｍ后，避免了血清样品接触薄膜边缘，引起　区带弯曲　Ｊ。）蘸取少许血清，先在滤纸上反复练习，因为点　样是整个实验成败的关键。点样要做到轻，准，匀，直。点样　时盖玻片必须与薄膜保持垂直，玻片应在点样线上停留３—５　秒，待血清渗入膜内，形成一条宽度、粗细均匀的直线。注意　是一次蘸取，一次点样　。因为点样时血清分布不均匀易导　透明处理的电泳图谱可直接用于定量测定。将各蛋白质区　带仔细剪下，分置于各试管中，另从空白背景剪切平均大小的　膜条置于空白管中。各管加入０．４　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ　４　ｍｌ，于３７℃　水浴２０　ｒａｉｎ（不时震荡），待颜色脱尽即用波长５８０　ｍｍ比色，　以空白管调零，读取各管吸光度值，然后计算各种蛋白质占血　清总蛋白的百分比。　二、结果　一致电泳图谱不齐。值得一提的是，经过多年的摸索，我实验室　已用小牛血清完全代替了人血清，学生实验效果良好。用小　牛血清代替人血清，既节约了宝贵的人血资源，又减少了实验　室污染，是个一举两得的好办法　Ｊ。（３）电泳：在电泳槽内加　入缓冲液，使两个槽内的液面等高（实验前准备：制作滤纸　条：根据电泳槽膜支架的宽度，剪成尺寸合适的滤纸条，取双　层滤纸条附着在电泳槽的两个膜支架上，滤纸一端与支架前　般在脱色后的膜条上呈现５条清晰的区带，依次为清　蛋白，ｏ１一球蛋白，Ｑ２一球蛋白，Ｂ一球蛋白，　一球蛋白。在　临床上，有一些疾病可出现明显的电泳图谱变化，如原发性肝　癌在清蛋白和ｎ１一球蛋白之间出现甲胎蛋白，多发性骨髓瘤　病人有时在Ｂ和　球蛋白之间出现巨球蛋白。下图为人血　清电泳与小牛血清电泳结果的对比。　沿对齐，另一端浸入ｐＨ＝８．６的缓冲液中。当滤纸全部润湿　作者单位：０３２２００山西医科大学汾阳学院生化实验室