一、目的与要求
1. 了解硫胺素测定的原理和意义。
2. 掌握荧光法测定硫胺素含量的操作要点和注意事项。 3. 了解荧光分光光度计等相关仪器的使用方法。
二、原理与意义
食品中VB1的存在形式：①常以游离态存在；②复合脂形式存在（磷蛋白）；③辅羧酶形式存在； VB1在绿色蔬菜、米糠、麦胚、花生、黄豆、牛乳、蛋黄和酵母中比较丰富，动物组织不如植物中含量丰富。
VB1为白色结晶，在中性、碱性条件下不稳定，易分解；在酸性条件下稳定，即使加热；易溶于水，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3。
样品经热稀酸处理，以提取维生素B1；如果样品中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离。如果所含维生素B1系游离态，可直接在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线照射下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其它荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。
三、仪器、器材与试剂
1. 仪器试剂
仪器
高压蒸汽灭菌器 恒温培养箱 荧光分光光度计 组织捣碎机 粉碎机 可调电炉（电磁炉）
2台
1台 1台 1台 1台 2～4台 1台
试剂
盐酸
无水乙酸钠 溴甲酚绿 氢氧化钠 淀粉酶 蛋白酶
人造浮石 乙酸 氯化钾 氯化钙 铁氰化钾
正丁醇（优级纯） 无水硫酸钠
1瓶 2瓶 1瓶 2瓶 1瓶 1瓶 2瓶 2瓶 3瓶 2瓶 2瓶 2瓶 1瓶
器材
研钵8cm 三角瓶100ml 烧杯100ml 烧杯50ml 移液管25ml 脱脂棉
Maizel-Gerson反应瓶
1000ml 500ml 250ml 容量瓶
100ml 25ml
盐基交换管 白点滴板 量筒50ml
样品（绿色蔬菜）
2个 20个 10个 10个 10个 1包 40个 5个 2个 2个 10个 20个 20个 10个 10个
蒸馏水发生器
2. 溶液配制
2.1 0.3mol/L盐酸：25.5ml浓盐酸，用水稀释至1000ml（配2L）。
2.2 2mol/L乙酸钠：164.0g无水乙酸钠，加热搅拌溶于水中，稀释至1000ml。
2.3 25%氯化钾：250.0g氯化钾溶于水中，稀释至1000ml（配3L ，2L装入一个2.5L的大试剂瓶，
用来配溶液；1L用来活化浮石）。
2.4 25%酸性氯化钾：8.5ml浓盐酸，用25%氯化钾溶液稀释至1000ml（配2L）。17ml浓盐酸，加
入2L的25%氯化钾溶液中。
2.5 15%氢氧化钠：75.0g氢氧化钠溶于水中，稀释至500ml（塑料或橡胶瓶塞）。
2.6 1%铁氰化钾：1g铁氰化钾溶于水中，稀释至100ml，当天配制，棕色瓶内保存（不使用，用来
配制溶液）。
2.7 碱性铁氰化钾：取6ml的1%铁氰化钾溶液，用15%氢氧化钠溶液稀释至90ml。用时现配，避
光使用。
2.8 3%乙酸溶液：120ml冰乙酸，加水稀释至1L；再加3L水（不使用，用来活化人造浮石）。 2.9 活性人造浮石：称取200g的40～60目的人造浮石，以5～10倍于其容积的热3%乙酸溶液搅洗
2次，每次10min；再用5倍于其容积的热25%氯化钾溶液搅洗15min；然后再用3%乙酸搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子；热蒸馏水中保存。
2.10 0.1mol/L盐酸：0.85ml浓盐酸，用水稀释至100ml（不使用，用来配制溶液）。 2.11 0.01mol/L盐酸：0.1mol/L盐酸100ml，用水稀释至1000ml。
2.12 硫胺素标准贮备液（1mg/ml）：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，用0.01mol/L盐酸
溶解稀释至100ml（冰箱中避光可保存数月，不入试剂瓶）。
2.13 硫胺素标准中间液（10μg/ml）：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释100倍（1ml，定容
100ml；冰箱中避光可保存数月）。
2.14 硫胺素标准使用液（0.1μg/ml）：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍（5ml，定容500ml），用
时现配（两组各配一次）。
2.15 氢氧化钠（0.1mol/L）：0.2g氢氧化钠溶于水中（或取2.5液1.3ml），稀释至100ml（不使用，
用来配制溶液）。
2.16 溴甲酚绿溶液（0.04%）：称取0.04g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入0.56ml的0.1mol/L氢氧化
钠溶液研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，加水至100ml。
四、操作步骤
1 样品准备
样品采集后用匀降机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）后于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后混匀使用。 2 提取
2.1取100ml三角瓶，精确称量记录一定量试样（估计硫胺素含量为10～30μg，一般称取2～10g
试样），加入50ml的0.3mol/L（或0.1mol/L）盐酸，混匀，瓶口加盖小烧杯后放入高压锅中加热水解，121℃下30min，凉后取出。
2.2 用2mol/L乙酸钠调其pH值为4.5（10ml左右，以0.04%溴甲酚绿为外指示剂，由淡黄变淡绿
即可）。
2.3 按每克干试样加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶，45～50℃温箱过夜
保温（约16h）。
2.4 冷至室温，定容至100ml后，混匀过滤，即为提取液。 3 净化（此步骤，一组舍弃样品，改做标准）
3.1 用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮
石使之达到交换柱的三分之一高度（保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石）。 3.2 用移液管加入提取液（或硫胺素标准使用液）20～60ml，记录体积（使通过活性人造浮石的硫
胺素总量为2～5μg）。
3.3 加入约10ml热蒸馏水冲洗交换柱，弃去洗液（重复三次，可用30～50ml一次即可）。 3.4 加入25%酸性氯化钾（90℃左右）20ml，收集此液于25ml容量瓶内，冷至室温，用25%酸性氯
化钾定容，即为试样净化液。
3.5 重复3.1～3.4，将20ml硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化
液。 4 氧化
4.1 将5ml试样净化液（或标准净化液）分别加入A、B两个Maizel-Gerson反应瓶。
4.2 在避光条件下（暗环境），将3ml的15%氢氧化钠加入反应瓶A，3ml碱性铁氰化钾溶液加入反
应瓶B，同时振摇约15s，加入10ml正丁醇；将A、B两个反应瓶，同时用力振摇（准确计时）1.5min。
4.3用黑布遮盖A、B反应瓶，静置分层后吸去（弃去）下层碱性溶液，加入2～3g无水硫酸钠（滤
纸条送入）使溶液脱水。
4.4重复4.1～4.3，用标准净化液代替试样净化液。 5 测定
5.1 荧光测定条件：激发波长356nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。 5.2 依次测定下列荧光强度：
Ub：试样空白荧光强度（试样反应瓶A）； U：试样荧光强度（试样反应瓶B）； Sb：标准空白荧光强度（标准反应瓶A）； S：标准荧光强度（标准反应瓶B）；
五、实验结果
1. 数据记录
试样空白荧光强度
2. 结果计算
(U-Ub)×c×V×V1
X = ×100 (S-Sb)×V2×m×1000
X： 样品中硫胺素含量，mg/100g；
U： 试样荧光强度； Ub： 试样空白荧光强度； S： 标准荧光强度； Sb： 标准空白荧光强度；
c： 硫胺素标准使用液浓度，μg/ml； V1： 用于净化的硫胺素标准使用液体积，ml； V2： 试样用于净化的提取液体积，ml； V： 试样水解后定容之体积，ml； m： 试样质量，g；
100/1000： 样品含量由μg/g换算成mg/100g的系数。
试样荧光强度
标准空白荧光强度
标准荧光强度
六、思考题
此次试验中，你认为哪些步骤是决定成败的关键？ 1. 试剂的正确使用（有的同学错用相近名称的试剂） 2. 调pH值，为酶反应提供适宜环境 3. 人造浮石的活化
4. 正确测定，即荧光分光光度计的正确使用
试验准备
1. 学生洗上次试验试剂瓶，准备使用器材（高压蒸汽灭菌锅洁净、加水） 2. 安排4～6人配制溶液；上次做完，洗下次试剂瓶子、并干燥 3. 购青菜，匀浆 4. 打扫卫生，试用仪器
实验注意事项：
1. 脱脂棉要少，且不要压实了，一定亲自指导 2. 人造浮石选颗粒的、较大的 3. 酸性氯化钾注意别沸腾的净剩盐了 4. 实验分三个时间段（提取、净化、测定）
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