多重RT-PCR方法检测新型甲型H1N1流感病毒的研究

多重RT-PCR方法检测新型甲型H1N1流感病毒的研究

作者：罗吉新,李海妙,林志达,王振全,苏惠龙,罗宝正 来源：《湖北畜牧兽医》2010年第10期

摘要:为了建立快速检测新型甲型H1N1流感病毒的多重PCR技术,根据GenBank中公布甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)的HA和NA基因序列,设计并合成两套特异性引物。使用TaKaRa公司的一步法RT-PCR试剂盒和自行设计合成的引物建立多重RT-PCR反应,按照预期的PCR产物序列合成的DNA作为阳性对照。结果表明,该方法具有良好的特异性,可以将甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)与传统甲型H1N1、H3N2、H5N1、H6N2和H9N2亚型流感病毒区分。该方法同时具有较高的灵敏度,最低可以检测到100个拷贝的阳性克隆质粒。在对183份发热病人临床咽拭子样品检测中发现了10份阳性样品,对350份猪鼻腔拭子样品检测全部呈阴性,结果与中国检验检疫科学研究院试剂盒检测结果一致,说明了该多重RT-PCR方法在临床检测新型甲型H1N1流感病毒方面具有广阔的应用前景。 关键词:多重RT-PCR;甲型流感病毒;H1N1亚型

中图分类号:S852.65文献标识码:B文章编号:1007-273X(2010)10-0008-03

流行性感冒病毒简称流感病毒(Influenza virus),属正黏病毒科(Orthomyxoviridae)。按其核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)和基质蛋白(matrix protein,M)的不同,可将流感病毒分成甲(A)、乙(B)、丙(C)3型。甲型和乙型流感病毒可以引起大的暴发流行和严重疾病;丙型流感病毒与普通感冒有关,主要在儿童中流行[1]。其中甲型流感病毒根据其表层血凝素蛋白和神经氨酸苷酶蛋白分类成不同亚型,至今为止发现16×9种不同组合的甲型流感病毒亚型。其中影响人类最重要的流感病毒是H3N2亚型和H1N1亚型,前者往往会与非常大规模的高死亡率有关[2]。 流感病毒普遍被认为是有能力重组其抗原基因结构和创造新的病毒株,比如改变其毒力、传染力或者宿主范围这些生物学特性[3]。基因重组在两个毒株之间发生是比较频繁的,但也有可能掺杂来源于不同物种的RNA片段。新型甲型H1N1即是一株在2009年全世界的人类范围中传播而暴发的变种流感H1N1病毒,7月份美国疾控中心(The U.S. Centers for Disease Control and Prevention,CDC)病毒学家在一名病患身上分离到一株甲型H1N1病毒,发现这株病毒由4种不同流感病毒株基因重组而成,包含有人流感病毒片段、来自北美和欧亚大陆的猪流感病毒片段和来自北美的禽流感病毒片段,这类病毒之前未曾报道有从人类或者猪的身上分离得到[4]。 流感病毒在变异重组过程中不断突破物种隔离和地理隔离的局限,在全世界范围内传播肆虐,给人类和家畜带来严重的威胁。由于病毒发生了变异,以往的病毒疫苗和诊断检验检疫技术

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已经不可以控制该病毒的传播,建立快速的检测方法从而进行早期诊断是有效防止疫情快速蔓延的方式之一。本研究根据GenBank中公布的甲型H1N1流感病毒2009年流行株的基因序列,设计了同时检测HA和NA基因的多重RT-PCR检测方法,期望为疫情的控制提供有力的技术支持。 1材料

传统的甲型H1N1和H3N2流感灭活病毒由广东温氏集团股份有限公司赠送。H5N1、H6N2和H9N2亚型流感灭活病毒购自哈尔滨兽医研究所。

新型甲型H1N1流感病毒阳性对照由上海旭冠生物技术有限公司合成,为甲型H1N1病毒2009年流行株HA和NA基因对应DNA序列。 2方法

2.1特异性引物的设计

在GenBank中搜索并获取2009年甲型H1N1流感病毒流行株的HA和NA的基因序列,利用分子生物学软件Clustal X进行多重序列比对,找到理想片段后用Primer Premier 5.0进行特异性引物设计,应用Oligo 6.0对引物评价分析。

为了满足检测新型甲型H1N1病毒的要求,引物的设计长度控制在15~30bp,引物扩增片段在300~

1 000bp之间,其G+C含量35%~60%,Ta值介于50~60℃。无发夹结构、二聚体、错误引发情况及上下引物之间二聚体形成情况,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上利用BLAST功能对引物与其他基因进行同源序列分析。 2.2病毒核酸的提取

取200μL样品浸出液或灭活病毒用于病毒RNA提取,操作方法按照Invitrogen公司的TRIzol reagent试剂说明书进行。用20μL DEPC H2O溶解提取的RNA,-20℃保存备用。取2μL用于多重RT-PCR反应。

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2.3多重RT-PCR反应的建立

多重RT-PCR反应采用TaKaRa RT-PCR一步法试剂盒,反应体系根据其说明书进行配制,共25μL,其中2×Buffer 12.5μL,引物H1F和H1R各1μL,引物N1F和N1R各1μL,终浓度都为根据优化结果确定,混合酶1μL,RNA 2μL,DEPC H2O补足至25μL。反应条件为50℃逆转录30min,94℃预变性2min;然后94℃ 15s,55℃ 30s,72℃ 1min,35个循环;72℃延伸7min。反应结束后1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。 2.4多重RT-PCR产物测序鉴定

PCR产物送往宝生物工程(大连)有限公司进行基因测序,将测序结果与在GenBank网站公布的新型甲型H1N1基因序列进行比对。 2.5多重RT-PCR反应条件的优化

2.5.1最佳多重RT-PCR上下游引物反应浓度的确定反应条件如2.3中进行,分别采用体系中上下游引物浓度均为0.2pmol/μL、0.4pmol/μL、0.6pmol/μL、0.8pmol/μL、1.0pmol/μL,25μL体系中其他因素不变进行RT-PCR反应,以确定最佳RT-PCR反应的上下游引物浓度。

2.5.2最佳多重RT-PCR反应退火温度的确定利用2.5.1中得出最佳RT-PCR反应的上下游引物浓度,在其他条件相同的情况下采取不同的退火温度进行RT-PCR反应,分别为53℃、54℃、55℃、56℃、57℃,检测出最优的RT-PCR反应退火温度以保证RT-PCR反应的特异性和产量。

2.6多重RT-PCR的特异性试验

使用传统的甲型H1N1以及H3N2、H5N1、H6N2和H9N2禽流感病毒RNA作为阴性对照,在相同的上述优化反应条件下进行多重RT-PCR反应,用来评价该方法的特异性。 2.7多重RT-PCR的敏感性试验

将H1和N1阳性对照质粒在紫外分光光度计上测定OD260数值,换算成质量浓度,再根据分子量大小和阿佛加德罗常数换算成摩尔浓度,即拷贝数。然后将质粒原液10倍梯度稀释成以下6个梯度浓度:106、105、104、103、102和10拷贝/μL。用建立的多重RT-PCR体系检测,检测到的重组载体的最少拷贝数即是该多重RT-PCR的灵敏度。 2.8临床样品检测

对珠海各个口岸采集的183份发热病人临床咽拭子样品和350份猪鼻腔拭子样品采用本研究建立的多重RT-PCR进行检测。同时,平行使用中国检验检疫科学研究院研制的甲型H1N1流感病毒检测试剂盒对以上阳性样品进行检测,检测方法按照其试剂盒说明书进行。

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3结果

3.1多重RT-PCR反应结果

分别以引物H1F、H1R和N1F、N1R建立单重RT-PCR反应,最后将引物合并于一管中建立多重RT-PCR反应。PCR产物琼脂糖电泳后所得的特异性片段与预期的片段大小达成一致,分别为395bp和732bp(图1)。 3.2多重RT-PCR条件的优化

3.2.1上下游引物浓度确定通过2.5.1中得出的琼脂糖电泳结果(图2)可以得知,最佳多重RT-PCR反应的上下游引物浓度是0.4pmol/μL。

3.2.2多重RT-PCR反应退火温度的确定用不同的退火温度进行多重RT-PCR反应,实验表明55℃为多重RT-PCR反应最佳退火温度(图3)。 3.3多重RT-PCR反应的特异性试验

采取本实验建立起的多重RT-PCR反应体系,进行特异性试验,只有阳性对照出现明显的电泳带,传统的甲型H1N1以及H3N2、H5N1、H6N2和H9N2禽流感病毒的检测结果均为阴性(图4)。

3.4多重RT-PCR反应的敏感性试验

通过进行对上述10个倍比梯度稀释浓度的质粒模板检测,从多重RT-PCR反应扩增产物电泳图可以看出,该方法最低可以检测到102拷贝/μL的模板(图5)。 3.5临床样品检测情况

实验室一直承担着检测新型甲型H1N1流感病毒项目业务,先后对183份发热病人临床咽拭子样品和350份猪鼻腔拭子样品进行检测,发现呈阳性的人咽拭子临床样品10份,猪鼻腔拭子样品中没有发现有阳性。阳性样品结果与中国检验检疫科学研究院试剂盒检测结果一致。 4讨论

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2009年4月墨西哥暴发的流感疫情被确认为新型甲型H1N1流感之后,世界各地纷纷投入大量的人力物力资源进行新型甲型H1N1流感诊断检测技术的研究,试图进一步遏制住疫情的蔓延传播,接着各种关于新型甲型H1N1流感病毒的检测技术相继出现。相对于传统的病毒诊断检测方法,一般是采用病毒分离法,该方法利用收集的动物咽肛拭子和疑似病料接种SPF鸡胚或MDCK细胞,然后对培养物进行血凝反应等的血清学诊断,此诊断方法操作繁杂、实验周期长、在采集样品和培养病毒的过程中造成环境的污染,而且随着病毒新的血清亚型、新的变异株不断地出现,传统的病毒分离法在实际应用中的局限性越来越明显。

本实验突破传统病毒诊断检测方法的局限性,表现快速、方便、流通量大等优点,从特异性实验可以看出,本实验建立起的多重RT-PCR体系只针对2009年出现流行的甲型H1N1流感毒株,并不能扩增之前公布的甲型H1N1流感病毒和其他流感病毒,具有高度的特异性。在敏感性检查中,本实验能检测到低至核酸浓度达到102拷贝/μL的水平,检测灵敏度高。所以本实验非常适合新型甲型H1N1流感病毒的快速检测工作。

参考文献:

[1]HAMPSON A W. MACKENZIE J S. The influenze virus [J].Med J Aunt,2006,185(10):S39-43.

[2]PARIANI E,AMENDOLA A.ZAPPA,et al.Molecular characterization of influenza viruses circulating in Northern Italy during two seasons(2005/2006 and 2006/2007)of low influenza activity[J]. J Med Virol.2008,80(11):1984-1991

[3]SIDORENKO Y,REICHL U. Tructured model of influenza virus replication in MDCK cells[J]. Iotechnol Bioeng,2004, 88(1):1-14.

[4]BUTLE D. Swine flu goes global[J].Natuer,2009,458(7242):1082-1083.