生防细菌B579的分离筛选及鉴定

维普资讯 http://www.cqvip.com 山东农业科学２００８，３：９１～９４　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　生防细菌Ｂ５７９的分离筛选及鉴定　杨秀荣，刘水芳，孙淑琴，刘亦学，张学文，张　惟　（天津市植物保护研究所，天津３００１１２）　摘要：本试验针对蔬菜上常见的几种土传病害进行生防细菌的分离、筛选，获得了１株生防细菌，定名　为１１５７９，经初步鉴定为芽孢杆菌属。　关键词：生防细菌；分离筛选；芽孢杆菌　中图分类号：￥４７６　．１１　文献标识号：Ａ　文章编号：１００１—４９４２（２００８）０３—００９１—０４　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｕｌｎ　Ｂ５７９　ＹＡＮＧ　Ｘｉｕ—ｒｏｎｇ，ＬＩＵ　Ｓｈｕｉ—ｆａｎｇ，ＳＵＮ　Ｓｈｕ—ｑｉｎ，ＬＩＵ　Ｙｉ—ｘｕｅ，ＺＨＡＮＧ　Ｘｕｅ—ｗｅｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｉ　（１￣ｎｊｉｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＰｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００１１２，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ　ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｔｏ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｓｏｉｌ—・ｂｏｒｎｅ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｏｎ　ｖｅｇｅｔａｂｌｅ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ．Ａｓ　ａ　ｒｅｓｕｌｔ，ｏｎｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｎａｍｅｄ　Ｂ５７９　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ　蔬菜土传病害发生面积广、种类多，诊断和防　（或蔗糖）２Ｏ；琼脂１８。　治困难。随着农作物种植密度及复种指数的增　②肉汁胨培养基：牛肉浸膏３；蛋白胨１０；　加，病原菌在土壤中逐年累积，致使土传病害有逐　ＮａＣ１　５；ｐＨ　７．２。　年加重的趋势，近年来成为限制农业生产的一类　③ＬＢ培养基：蛋白胨１０；酵母提取物５；ＮａＣ１　主要病害。为此，笔者通过大量分离筛选试验，获　１０；ｐＨ　７．２。　得了能够有效控制该类病害的生防细菌Ｂ５７９，并　１．２试验方法　对其进行了初步鉴定，为该菌的开发利用奠定了　１．２．１　土样的采集在天津市近郊蔬菜种植区　基础。　（西青区辛口镇、武清区灰锅口、北辰区韩家墅、　ｌ材料与方法　静海等）蔬菜大棚中，采集黄瓜、茄子等健康植株　和发病植株根际周围０～２０　ｃｍ的表层土壤，装人　１．１试验材料　无菌聚乙烯塑料袋，封口。　１．１．１试验茵种生防细菌Ｂ５７９、Ｂ５８２从津郊　１．２．２菌株的分离采用稀释平板分离法：称取　蔬菜种植田分离获得，现保存于天津市植物保护　土样１０ｇ，加人有玻璃珠的９Ｏ　Ｉｎｌ无菌水的三角瓶　研究所生防室。立枯丝核菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎｉ）、　中，２００　ｒ／ｍｉｎ振荡３０　ｍｉｎ，即成１Ｏ　菌悬液，然后　禾谷镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｇｒａｍｉｒｕｍ）、辣椒疫霉菌　从所得菌悬液中吸取５　Ｉｎｌ加入４５　Ｉｎｌ无菌水的三　（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｃａｐｓｉｃｉ）、茄子枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　角瓶中，依此稀释，将土壤样品稀释成１Ｏ一、　ｓｏｌａｎｉ）、黄瓜枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）５种　１Ｏ一、１Ｏ一　三个浓度，用无菌吸管吸取０．１　ｍｌ土　土传病原菌由天津市植物保护研究所生防室、病　壤稀释液，接种在预先倒好的肉汤培养基上，然后　害室分离保存。　用玻璃刮刀将土壤稀释液涂布均匀，２０　ｍｉｎ后将　１．１．２培养基（ｇ／Ｌ）　平板置于２４℃生化培养箱中培养，４８　ｈ后挑取培　①ＰＳＡ（或ＰＤＡ）培养基：马铃薯２００；葡萄糖　养特征相异的单个菌落于斜面上。　收稿日期：２００７—１２－２９　基金项目：天津市农业科学院院长基金项目（项目编号：０５０１２）　作者简介：杨秀荣（１９７２一），女，天津人，副研究员，主要从事植物病害及生物防治研究工作。Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｌｕｒｏｎｇｙａｎｇ８８＠１２６．ｔｏｍ　致谢：衷心感谢天津科技大学王敏教授在菌株鉴定及试验过程中给予的热情指导和大力支持。　维普资讯 http://www.cqvip.com 山东农业科学　２００８年　１。２。３病原茵的培养和孢子悬浮液的制备在　无菌操作条件下，将立枯丝核菌、禾谷镰刀菌等５　种病原菌接种在ＰＳＡ培养基上，置于２５℃生化培　养箱中培养，待菌丝长满全培养皿后待用。将黄　瓜枯萎病菌接种在ＰＳＡ平板上，２５℃恒温培养６　天，用灭菌的毛笔刷刷下菌落上的孢子，经双层纱　布过滤，用血球计数板计数，配置成５×１０。ｃｆｕ／ｍｌ　孢子悬浮液，待用。　１。２。４生防细菌的初筛　将从土壤中分离的细　菌菌株采用对峙培养法进行初筛，以立枯丝核菌　为靶标菌。首先将立枯丝核菌用打孔器制成直径　为５　ｒａｌｎ的菌片，用接种针将该菌片挑取于ＰＳＡ　平板的边缘，然后将带有不同编号的细菌菌株接　种在ＰＳＡ平板中央，培养２４　ｈ后测定病原菌的半　径，然后按照公式计算抑菌率。　抑菌率（％）＝［（病原菌半径一对照半径）／　对照半径１×１００。　１．２．５　生防细菌的复筛　以立枯丝核菌、禾谷镰　刀菌、茄子枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、辣椒疫霉菌　５种土传病原菌为靶标菌，按照“１。２。４”方法进行　复筛，（除立枯丝核菌外，先将其余病原菌培养４８　ｈ后再接种待测细菌），３天后，测定病原菌半径，　计算抑菌率。　１．２。６生防细菌Ｂ５７９的生理生化特性　参照　方中达等（１９９７）　的方法，观察测定生防细菌的　性状、大小、鞭毛、革兰氏染色等生理生化特性。　１。２。７分子生物学鉴定法采用裂解法提取生　防细菌Ｂ５７９的总ＤＮＡ，用引物２７ｆ（５　一ＡＧＡ　ＧＴｒ　ＴＣＣ　ＴＧＡ　ＴＣＣ　ＴＧＧ　ＣＴＣ　ＡＧ一３，）和１　４９２ｒ（５　一　ＧＧＣ　ＴＡＣ　ＣＴｒ　ＧＴｒ　ＡＣＧ　ＡＣＴ一３，）进行ＰＣＲ扩　增。ＰＣＲ反应体系（５０　１）为：１０×ＰＣＲ缓冲液５　Ｉｘｌ，引物２７ｆ和１　４９２　ｒ（２５　ｐｍｏ１）各０．５　Ｉｘｌ，ＤＮＡ　模板１．５　ｌ，Ｅｘ—Ｔａｑ酶（５　Ｕ／￣１）０．２５　，超纯水　３７．２５　Ｉｘｌ。ＰＣＲ扩增程序为９５℃３　ｍｉｎ；９４℃１　ｍｉｎ，５５℃１　ｍｉｎ，７２℃１。５　ｍｉｎ，３０个循环；７２ｏＣ　８　ａｒｉｎ。扩增产物经纯化后，由上海生工生物化学有　限公司直接测序，测序用双向引物测序，测序用引　物２７ｆ和１　４９２ｒ，将测得的基因序列通过Ｂｌａｓｔ程　序与ＧｅｎＢａｎｋ中核酸序列进行对比分析（ｈｔｔｐ：／／　ＷＷＷ．Ｎｃｂｉ．ｎｌｒｎ　ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ），相似序列进行多　重匹配排列分析。　１．２．８　生防细菌Ｂ５７９活性成分的分离　将　Ｂ５７９接种于ＬＢ液体培养基中，培养２４　ｈ，为菌体　发酵液。取出一部分菌体发酵液，进行离心　（５　０００　ｒ／ｍｉｎ，１０　ｍｉｎ），将上清液用细菌过滤器过　滤，滤液为拮抗细菌的胞外分泌物，将上述离心所　得的菌体用０．９％生理盐水洗脱，反复洗２—３　次，用超声波细胞破碎仪进行破碎，再进行离心　（５　０００　ｒ／ｍｉｎ，１０　ｍｉｎ），取上清液经过细菌过滤器　过滤，滤液即为胞内分泌物，待用。　１。２．９　生防细菌Ｂ５７９活性成分的测定　以黄瓜　枯萎病菌为靶标菌，对活性成分进行测定。滤纸　片法：将黄瓜枯萎病菌分生孢子悬浮液１００　Ｉｘｌ　（１０　孢子／ｍ１），加入灭菌的ＰＤＡ平板，用玻璃刮　刀涂布，使其分布均匀，将直径６　ｍｍ的滤纸片分　别在三种液体（菌体培养发酵液、胞外分泌物、胞　内分泌物）中浸泡２０　ｍｉｎ，然后用接种针挑取放　置于刚刚涂布有指示菌的平板上，设３次重复，放　置２４℃的生化培养箱中培养，观察抑菌效果。　２结果与分析　２．１　生防细菌的分离与筛选　２．１．１　土样的采集及细菌的分离　在天津近郊　蔬菜种植区的不同作物根表及根围采集土样２８　份，从２８份土壤中分离获得细菌菌株１５８株。　２。１。２　生防细菌的初筛　由表１可以看出，在　１５８株细菌中，１３４株细菌菌株对立枯丝核菌无抑　菌作用，占总数的８４．８％，１８株细菌对立枯丝核　菌有较弱的作用，占总数的１１。４％，６株（分别编　码为Ｂ５７３、Ｂ５７９、Ｂ５８２、Ｂ５５３、Ｂ５７５、Ｂ５０７）细菌对　立枯丝核菌有较强的抑制作用，占总数的３。８％。　细菌对立枯丝核菌的作用分为以下几种情况：有　的细菌生长速度很快，在较短的时间占满平皿空　间，导致病原菌无充足的生长空间；有的细菌虽然　生长速度慢，但是能够产生很强的拮抗物质，产生　明显的抑菌带；有的细菌对立枯丝核菌无影响。　表１　细菌的筛选结果　抑菌率　０　＜５０％　至　盒生　菌株数　１３４　１８　６　１５８　所占比例（％）　８４．８　ｌ１．４　３．８　１００　２．１。３　生防细菌的复筛　以立枯丝核菌、禾谷镰　刀菌、茄子枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、辣椒疫霉菌　５种土传病原菌为靶标菌，进行抑菌测定，最终筛　选出Ｂ５７９、Ｂ５８２两株优良拮抗细菌，它们对土传　病原菌的抑菌率分别达到７８％和７１％以上（见表　２），其中Ｂ５７９对５种土传病原菌的作用更强。　维普资讯 http://www.cqvip.com

第３期　表２　杨秀荣等：生防细菌Ｂ５７９的分离筛选及鉴定　６株生防细菌对土传病原茵的抑茵活性　鞭毛多根周生，芽孢椭圆形，端生，大小为（０．５～　０．７）Ｉｘｍ×（１．１～１．５）Ｉｘｍ，好氧性，葡萄糖利用、　Ｖ—Ｐ反应、接触酶反应、硝酸盐还原、淀粉水解均　呈阳性，根据“伯杰氏细菌学鉴定手册”鉴定，可初步　推断生防细菌Ｂ５７９为芽孢杆菌属（Ｂａｃｉ／／ｕｓ　ｓｐ．）。　表３　形状　大小　鞭毛　生防细菌Ｂ５７９生理生化特性　形态特性　杆状（图２ａ）　生理生化特性　葡萄糖利用　＋　２．２生防细菌Ｂ５７９的鉴定　２．２．１　生防细菌Ｂ５７９的生理生化特性　由表３　（０．６一１．１）ｐ，ｍ×（１．５—２．５）　ｍ好氧性和厌氧性好氧性　革兰氏染色　Ｇ＋　Ｖ—Ｐ反应　＋　多根周生（图ｌａ）　接触酶反应　＋　可知，生防细菌Ｂ５７９的形状为杆状，大小为（０．６　～１．１）ｌａ，ｍ×（１．５～２．５）ｌａ，ｍ，革兰氏染色呈阳性，　椭圆形，端生（图ｌｂ）　硝酸盐还原　ｍ×（１．１一１．５）　ｍ　淀粉水解　芽孢大小　（０．５—０．７）ｐ，芽孢　＋　＋　ａ：菌体形态　ｂ：芽孢形态　图１　Ｂ５７９的菌体形态及芽孢着生情况　２．２．２分子生物学鉴定生防细茵Ｂ５７９　用引　物２７ｆ（５　一ＡＧＡ　ＧｒＩＴ　ＴＣＣ　ＴＧＡ　ＴＣＣ　ＴＧＧ　ＣＴＣ　ＡＧ　一３’和１　４９２ｒ（５　一ＧＧＣ　ＴＡＣ　ＣＴＹ　ＧｒＩＴ　ＡＣＧ　ＡＣＴ　一３，进行ＰＣＲ扩增，测得的基因序列为：　３；ＴＣＴＧＡＧＡＧ１．１　ｒ（；＾１ＣＣ１　；ＧＣＴｃ＾ＧＣ｝＾ＴＣ　ＬＡＡＧＣ　Ｘ；ＧＣ　ｏｃ　ｒＴＧＴｔ＾＾：ｒ＾Ｃ　ｒＧｃ＾＾Ｃ力ｆ（：ＧＡ《　０ＧＧ　ＧＡＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧ１。ｒＴＴＣＡ　ｒＡＴＯＧＧ＾　＿Ｉ　ｒＣ１∞１℃｝（》ＣＡＧＧＡ＾ＴＴＡ＾Ｃ　＝（）Ｇｌ１℃＾ＴＣＴＴＣ￣ＡＴＡＣＧＡ　ＧＧＴＧＡＣＣｎ　＾ＣｃＧＴＧＣ　ＴＡ＾ＯＣＴＧ＾ＣＡｌＧＴＣ陷ＧＧＣＴＡＡＡＴＡｃＧＴＧＣＣＴＣＣＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＧＴＣ　ＴＣ，ＣＧＣ￣ＣＣＣＣＣ－ＧＴＣＡＴ。Ｇ１ｊ０ＧＩ　ＩＴＣＡＴＧＧＡＡＯＧＧＣＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＣＡＣ　ＡＧＣ．ＡＧＣＧＴＧＧＧＡ￣ＧＣＧＡＧＡＧＡＴＧＴＧＡＧＴＡＣＡｃＡＧ￣ＧＣＧＴＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＧＴＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＣＧＡＧ　Ｔ　Ｃ　Ｃｊｃ　＾－‘；ＪＡＧＣ＾Ａ１　）∞ＡＴ＾ＴＧ＾Ｔ＾ＧＴｏＧＴＣ：ＡＴＣ＾１１℃ＡＧ１１　３（｝ＧＣＡＣ　Ｃ　１ＤＧＧＯｏＧＣ：（）ＧＫ；１’ＧＣＣ　ＴＣＡＡｔＧＧＡＣＡＧＡＡＣＡＡ＾ＧＧＧＣＡＧＣＧＡＡＧ１℃ＧＣＧＡＧＧＴＩ＿ＡＡＧＣＣＡＡＴｃＣＣＡＣ＾＾＾ＴＣ　ＧＴＴｃＴＣＡＧＴ　黜　ＧＴ（：１　Ｇ　Ｃ　）ＧｌＧ　；ＣＧＴＧＡ＾Ｇ（：１　ＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＡＴＧＡＴＣＡＴＣＡＧＡＣＣＧ　ＣＣＧＴＧＡＡＴＴＡＴＴＣＣＣＣｃＧＣ　ｒＩｌＧ　ＡＩ：ＡｃＡ０ＣＡＴｃＯｅＡＣＴＣＡＣＣＣＣＧＡＣＡＧＴＴＩ￣ＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣ　ＧＯ０Ｇ＾　ＧＧＴＡＧｃ　Ａ＾ＯＣＴＩ＇ＡＡＣＡ　０Ｃ￣ＡＡＯＣＡＡＯＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＡ￣ＡＴｃＴＧＡ＾ＧＧ他ＣＣ￣ＧＧＡＴＣＡＯＣＴｃＣＴＣＡ－５’　ＴＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡ　维普资讯 http://www.cqvip.com 山东农业科学　将该序列通过Ｂｌａｓｔ程序与ＧｅｎＢａｎｋ中核酸　２００８盔　数据库进行对比，分析表明：Ｂ５７９与枯草芽孢杆　３结论与讨论　菌的遗传距离最小，同源性达到８３％，由此进一　室内抑菌试验表明，生防细菌Ｂ５７９对土传　病原菌有较强的抑制作用，抑菌率达到７８％以　步推断该菌为芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）。　２．２．３　生防细茵Ｂ５７９活性成分的初步分析通　上。另外，经初步鉴定，生防细菌Ｂ５７９与枯草芽　过对生防细菌Ｂ５７９发酵液中三种分离成分（菌　孢杆菌遗传距离最近，同源性达到８３％，确定该　体、胞外产物、胞内产物）对黄瓜枯萎病的抑制作　菌为芽孢杆菌，属于哪个小种，有待进一步鉴定。　用分析，发现菌体对病原菌具有拮抗作用（见图　生防细菌Ｂ５７９是从天津近郊蔬菜种植区分　２，ａ），孢外产物（发酵液上清液）表现出较弱的抑　离筛选获得，由于天津地区土壤大多为盐碱土，因　菌作用（见图２，ｂ），而胞内产物对病原菌没有表　此该菌的开发利用，对于防治这一特殊土壤条件　现出抑制作用。　下的土传病害具有重大意义。　参考文献：　顾言荣．怎样防治保护地土传病害［Ｊ］．农村新技术，　２００６，３：１４—１５．　［２］　李罕琼，黄水招．大棚作物病害发生特点与防治对策［Ｊ］．　上海蔬菜，２００５，６：５７—５８．　［３］　方中达编．植病研究方法［Ｍ］．南京：南京农业大学出版　ｂ　社，１９９７．　ａ：带菌发酵液对黄瓜枯萎病菌的抑制　ｂ：孢外产物对黄瓜枯萎病菌的抑制　［４］　黎起秦，叶云峰，蒙显英，等．内生细菌１３４７菌株的鉴定及　其对番茄青枯病的防效测定［Ｊ］．中国生物防治，２００５，２１　（３）：１７８—１８２．　图２　Ｂ５７９的拮抗效果照片　［５］　沈爱华，张炳欣，李斌，等．黄瓜苗根围拮抗细菌）（３的　分子鉴定［Ｊ］．应用生态学报，２００３，１４（９）：１５２１—１５２４．　（上接第９０页）全盐的含量随时问的推移逐渐增　大，且废水灌溉量越大全盐含量越高。　越好，但同时下渗水中有机物、总氮与全盐含量也　水利，２００２，１０：１２３—１２５．　［２］　宋晓焱，尹国勋，谭利敏，等．污水灌溉对地下水污染的机理　研究［Ｊ］．安全与环境学报，２００６，６（１）：１３６—１３８．　南造纸，１９９８，３：３４—３８．　３．３新亚铵法制浆中段水灌溉水量越大水稻生长　［３］　郝瑞霞，罗人明，程水源．亚铵法制浆废水治理技术［Ｊ］．湖　　黄俊友，胡晓东，俞青荣．污水灌溉对水稻生长影响的实验　随之增加，为了避免污染地下水，建议废水经过土　［４］地一植物处理系统之后，收集下渗水再用于大面积　［５］　赵建芬，马香玲，韩会玲．改进的污水土地处理系统去污试　农田灌溉。　验研究［Ｊ］．南水北调与水利科技，２００５，３（２）：４３—４５．　参考文献：　［６］　彭燕梅，王雪波．楚雄市污水土地处理系统的处理效果分析　研究［Ｊ］．农机化研究。２００６，ｌ：１７７—１７９．　［Ｊ］．楚雄师范学院学报，２００２，１７（３）：７７—８０．　【１］　刘润堂，许建中．我国污水灌溉现状、问题及对策【Ｊ］．中国