一步酶法制备药物中间体7-氨基头孢烷酸

赵玉新;户巧芬;刘治林

【摘 要】目的 主要介绍一步酶法制备7-ACA较两步酶法的优势,重点探讨一步酶法制备7-ACA的酶解条件、纯化技术、结晶工艺.方法 7-ACA一步酶法和两步酶法的优势对比分析,酶的选择、一步酶法酶解反应条件、裂解液纯化技术、裂解液结晶技术的筛选.结果 确定了酶解条件一反应温度20～25℃、PH8.5、时间60min,烷烃类萃取纯化条件、结晶条件.结论 该方法制备的7-ACA质量好,收率高. 【期刊名称】《中国抗生素杂志》 【年(卷),期】2010(035)006 【总页数】4页(P435-438)

【关键词】7-氨基头孢烷酸(7-ACA);头孢菌素C;一步酶法;酶解条件;纯化技术;结晶工艺

【作 者】赵玉新;户巧芬;刘治林

【作者单位】哈药集团制药总厂科研开发中心,哈尔滨,150046;哈药集团制药总厂科研开发中心,哈尔滨,150046;哈药集团制药总厂科研开发中心,哈尔滨,150046 【正文语种】中 文 【中图分类】R978.1

酶法制备7-ACA生产技术由于具备安全、环保和低成本优势，在当前国内应用十分广泛，而该技术中主要在产业化应用的是两步酶法技术，即通过D-氨基酸氧化

酶、GL-7ACA酰化酶两步酶法实现酶法7-ACA的工业化制备，但存在酶解路线长、氧化条件控制难度大、设备条件高的缺点。本文主要研究一步酶法的控制参数，并优化出最佳技术条件，见表1。 1 仪器与材料 1.1 仪器与试药

BIOTECH-2M生物酶反应器 (上海保兴生物设备工程有限公司)；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；氨水(工业级)、EDTA-2Na(试剂) 、结晶助剂等。

1.2 酶的选择及活力检测方法 1.2.1 酶的选择

经过查阅国内外文献资料[1-3]及大量的试验筛选，采用头孢菌素C酰基转移酶 (NRB-103)可以直接把CPC转换为7-ACA，不必进行GL-7-ACA转换的中间过程，反应效率相当于化学法，而且能得到质量良好7-ACA。这种头孢菌素C酰基转移酶 (NRB-103)新法制备7-ACA (One-step enzymatic process，一步酶法)，同时兼具化学法的优势(高效率和纯度)及两步酶法的优势(高经济性和环境保护)。 表1 一步酶法和两步酶法制备7-ACA优势对比分析Tab.1 Comparison and analysis of one-step and two-step enzymatic process

头孢菌素C酰基转移酶 (NRB-103)的应用特点：A、未固定化时活力：13U/mg；B、固定化后应用活力：40～60U/g；C、固定化后干品活力：80～130U/g；D、载体的固定化：通过共价键连接；E、应用形式：从保存酶的磷酸氢二钾的缓冲溶液中过滤，用纯化水洗，抽干；F、湿含量：50～52%；G、粒径：0.1～0.3mm (60～150目)；H、稳定性：在4℃条件下，不少于12个月。 1.2.2 活力测定及一步裂解原理

原理 头孢菌素C(CPC)在头孢菌素C酰基转移酶(NRB-103)作用下，直接生成

7-ACA。

1U=每分钟从1μmol的CPC生成1μmol的7-ACA所需要的酶量。 CPC溶液制备 将2.21g CPC(75%)加入180mL缓冲液中(5mmol K.P.b,pH 8.5)，用NaOH (2mol/L)调解pH值到8.5，直到CPC溶解，然后调整缓冲液体积到200mL，制备20mmol/L CPC 溶液。

活力测定 A、精密称取头孢菌素C酰基转移酶(NRB-103)1g，加入酶反应器中；B、将200mL的CPC溶液(pH8.5) 加入酶反应器中；C、在控制25℃搅拌的条件下，用0.05mol/L的NaOH调节pH至8.5；D、计算在10min内NaOH的消耗量。 活力计算

NRB-103酶应用活力测定结果：按照上述方法对不同批NRB-103应用活力进行测定，结果见表2。 2 方法与结果 2.1 酶裂解反应条件

2.1.1 CPC-Na裂解液浓度的确定

CPC浓度在25～125mmol范围内进行试验，CPC acylase (NRB-103)浓度7.5Ku/L条件下，用12.5%的氨水控制反应pH8.5、温度20℃、转速250r/min、反应60min进行试验，结果见图1。

可见，分析得出CPC浓度在50～75mmol/L时，7-ACA转化率达到95%，可以确定50～75mmol/L为最佳反应浓度。 2.1.2 裂解PH的确定

在头孢菌素C酰基转移酶 (NRB-103)的pH是7～9之间、CPC浓度75mmol，其它条件不变的条件下进行试验，结果见图2。

图1 CPC不同浓度条件下7-ACA的转化率Fig.1 conversion rate of 7-ACA in different concentrations of CPC solution

表2 NRB-103应用活力测定结果Tab.2 Activity of NRB-103 enzymeNRB-103应用活力 /(u/g)

可见，分析得出pH在8.5时，7-ACA转化率达到95%，可以确定pH8.5为最佳反应pH值。 2.1.3 裂解温度的选择

在不同温度15～35℃范围内，pH、CPC-Na裂解液浓度为以上试验选择的最佳条件，其它条件不变的条件下进行试验，结果见图3。

可见，分析得出温度在20～25℃，7-ACA转化率达到95%，可以确定20～25℃为最佳反应温度。 2.1.4 裂解时间的确定

在所有反应条件同上的条件下进行试验，在不同反应时间进行监测7-ACA转化率。结果见图4。

可见，分析得出反应60min，7-ACA转化率达到95%，可以确定60min为最佳反应时间。 2.2 裂解液纯化技术 2.2.1 蛋白质浓度的测定

图2 pH不同条件下7-ACA的转化率Fig.2 the conversion rate of 7-ACA under different PHs

图3 温度不同条件下7-ACA的转化率Fig.3 the conversion rate of 7-ACA under different temperatures

CBG试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250溶于95%乙醇50mL，加蒸馏水800mL。加85%磷酸100mL。最后定溶至1000mL，过滤装棕色瓶中保存。

蛋白标准母液：30mg牛血清蛋白，溶于100mL 0.9%氯化钠中。

样品测定：准确吸取0.5mL样品，加入CBG试剂5mL摇匀，室温静止3min，以空白调零，紫外分光光度计在595nm处比色。适当稀释样品，以保证吸收值在0.2～0.4之间。蛋白浓度=吸收值读数×0.1188稀释倍数。 2.2.2 裂解液纯化

由于酶法制备7-ACA，蛋白含量较高，在裂解液中加入10%的二氯甲烷或氯仿去除蛋白和氨基酸进行萃取分离，控制在4℃条件下搅拌10min，静止分层10min，将二氯甲烷或氯仿层分离，弃取。通过纯化，经上述蛋白质浓度测定法测定，去除了大量大分子蛋白和氨基酸等杂质，经过下游产品头孢唑林、头孢曲松、头孢噻肟等品种验证，没有蛋白乳化现象，得到了质量较好的产品。 2.3 裂解液结晶技术

由于两步酶法制备的7-ACA，首先CPC 在D-氨基酸氧化酶作用下，转化为 GL-7-ACA ，GL-7-ACA在GL-7-ACA酰化酶作用下生成7ACA，多了一步中间过程控制且需要在氧气作用下，控制难度比较大，按常规结晶技术，得到的晶型细，纯度低，过滤速度慢。一步酶法直接由CPC转化为7-ACA，经过纯化后的裂解液加入活性炭脱色，EDTA金属络合剂，调节pH，搅拌，过滤，滤液降温，加入高分子聚合物的结晶助剂，慢搅拌下，用约60min，采用特殊设备进行液面底部滴加15%的盐酸，结晶，调整pH至3.8，搅拌养晶60min。得到晶型较大，晶型好，纯度高，通过加入结晶助剂，降低了产品在体系中的溶解度，改善了产品晶形，大大提高结晶颗粒度和结晶产品质量，提高过滤速度和干燥效率。 图4 不同反应时间7-ACA转化率Fig.4 the conversion of 7-ACA with different reaction time 2.4 质量检测结果

按照上述优化的裂解、纯化、结晶技术条件，照2.1项下路线及方法验证，结果如

下：CPC-Na一步酶法裂解率97.5%，7ACA/CPC-Na重量收率为43.7%，制备得到的7-ACA质量检测结果见表3。

表3 7-ACA质量检测结果Tab.3 Analysis results of 7-ACA 3 讨论

7-ACA一步酶法技术已经在理论上得到了国内外广泛研究，特别是一步7-ACA裂解酶的发酵、纯化技术得到了应用。本次研究进一步优化了一步酶法制备7-ACA的工艺条件，结果表明，酶解最佳条件为：CPC-Na裂解液浓度50～75mmol/L、裂解温度20～25℃、pH8.5、时间60min；二氯甲烷等烷烃溶剂在酶裂解液纯化过程中对去除大分子蛋白和氨基酸等杂质效果显著；结晶过程中加入结晶助剂和分散相大大提高结晶颗粒度和结晶产品质量，提高过滤速度和干燥效率。

本次研究的结果也说明，在上述最佳酶解条件下，一步裂解酶（如NRB-103酶）的活力有所提高；但是，由此所制备的7-ACA在下游品种化学合成中对两项分相速度是否有影响，结晶助剂的残留是否对下游产品质量稳定性产生影响等问题，有待于进一步的实验探讨。 参考文献

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