核酸检测技术的应用

1资料与方法

1.1检测方法及判定规则305912份全血标本和单采血小板标本进行常规ELISA检测。部分标本因为ELISA检测项目不合格直接被淘汰而未进入到核酸检测环节，有303616份标本分别进行混样核酸检测（191222人份）和单人份核酸检测（112394人份）。⑴混样核酸检测：按照试剂盒说明书要求，筛选ELISA检测合格标本进行8个标本混样核酸检测，无反应性pooling的8个标本视为该项目核酸检测合格，有反应性pooling进行标本的拆分单检，拆分无反应性的标本判为合格，拆分亦有反应性的标本判为该项目核酸检测不合格。⑵单人份核酸检测：采用单个标本核酸检测模式，按照试剂盒和全自动核酸检测设备要求进行检测，检测无反应性的标本视为HBVDNA、HCVRNA、HIV-1RNA项目联检合格，检测有反应性的标本则视为HBVDNA、HCVRNA、HIV-1RNA项目联检不合格。

1.2统计学处理采用x²检验,比较各项目不合格率的差异，p<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1单检模式及混检模式下的NAT结果303616人份标本进行核酸检测，其中112394人份采用单人份核酸检测系统进行检测，检出单独NAT不合格数148例，不合格率为1.32‰；191222人份标本采用另外的混样核酸检测系统进行检测，检出单独

NAT不合格数63例，不合格率为0.33‰.两者不合格率比较，有显著性差异（P<0.05）。

2.2全血标本和单采血小板标本ELISA检测结果305912份全血标本和单采血小板标本中，采用ELISA方法检测全血标本278214人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数2536例，不合格率为9.1‰；采用ELISA方法检测单采血小板标本27698人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数78例，不合格率为2.8‰.两者不合格率比较，有显著性差异（P<0.05）。

2.3全血标本和单采血小板标本NAT检测结果NAT不合格结果包括两类，一类为NAT反应性而ELISA无反应性，即为单独NAT不合格结果,此类不合格的检出即为NAT在血液筛查中所发挥的检测效能。另一类为NAT反应性ELISA亦为反应性。303616份标本中全血标本和单采血小板标本中，276018人份全血标本的单独NAT不合格数186例，不合格率为0.67‰；27598人份单采血小板标本的单独NAT不合格数为26例，不合格率为0.94‰.两者不合格率比较，无显著性差异（P>0.05）。

3讨论

确保临床输血的血液安全是血站工作的重心。目前，国内已有多家血站采用ELISA+NAT方法进行检测的筛查策略。NAT技术具有高度特异性和敏感性，可以有效缩短ELISA检测的“窗口期”，还可以避免因病毒变异、隐匿性感染等原因造成的ELISA方法的漏检，在上世纪末，美欧日等国家血站已开展血液相关病毒核酸检测。我国卫生和计划生育委员会于2010年6月开始对献血者血液进行HIV、HBV和HCV病毒核酸检测的试点，拟定2015年国内血站全面实施核酸检测技术。因为NAT检测技术对实验操作

的各个环节和实验室环境等都有很高的要求，因此NAT实验室质量管理水平的高低直接关系到这项技术的实际应用效果。如何根据自身实验室的情况建立适宜的检测模式，持续改进以提升检测效能，既防止漏检，又最大限度降低因为NAT假阳性而导致的血液淘汰是今后我们需要认真探讨的问题［9］。本中心作为首批参评的试点单位，自2010年6月对献血者血液常规开展NAT检测，在此期间我们将全血标本和单采血小板标本的血液检测模式进行了优化，将NAT检测技术应用于不同献血人群的血液筛查在一定水准上提升了检测效能。

本中心自2013年1月-2014年10月间采用单检模式进行标本的核酸检测，NAT不合格率为1.32‰，明显高于同期采用混样核酸检测系统所得到的0.33‰NAT不合格率。因为检测系统不同、检测模式的差异，导致其检测灵敏度不同、检出率也不同。对于混样核酸检测系统而言，pooling的方式势必有稀释标本的作用，其检测灵敏度也一定低于试剂说明书所提供的检测灵敏度。单人份核酸检测系统的检测灵敏度高于混样核酸检测系统，其检出率也相对较高，因此，NAT检测效能的影响因素与所采用的检测模式、检测灵敏度相关。在单采血小板的标本中，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV1/2三项ELISA检测不合格率为2.8‰（79/27698），明显低于同期全血标本9.1‰(2536/278214)的不合格率。因为我中心单采血小板捐献者85%以上来自于重复献血者，受过更多的血液安全教育，每次献血都进行体检和检测，也就是通常所说的“低危献血人群”，传播输血传染病的危险性最小。而捐献全血的重复献血者占献血人群比例不足50%。全血和单采血小板标本均有单独NAT不合格检出，不合格率分别为0.67‰（186/276018）和0.94‰（26/27598）。因为病毒感染者“窗口期”献血，病毒变异，免疫静默感染等原因，导致单纯抗原或抗体血清学检测不能有效保障血液安全。NAT直接检测病毒核酸，能显著缩短血液感染病毒的检测“窗口期”，与ELISA方法形成互补，有效发挥其检测效能。我

国已将NAT血液筛查纳入新的输血技术操作规程。国内多家采供血机构将NAT技术应用于献血者的血液筛查中，均有不同水准HBsAg阴性而HBVDNA的阳性检出，从而发挥了NAT技术应有的检测效能。

综合相关文献的报道，随着核酸检测技术在血液筛查检测中越来越多的被广泛应用，阻断部分因ELISA检测“窗口期”漏检而导致的输血传染病发生。其检出窗口期感染和隐匿性感染的能力得到了更为广泛的数据支持。本研究数据显示：单采血小板捐献者ELISA三项不合格率明显低于全血捐献者，而单独NAT不合格率却高于全血捐献者，证实无论是否为低危的重复献血者，ELISA检测存有漏检而NAT在不同血液成分捐献者中进行血液筛查，可以发挥其不同水准的检测效能。与此同时，NAT检测效能的发挥与献血间隔相关。献血间隔越短，在“窗口期”内献血的机率就加大［18］，NAT检出病毒窗口期的几率越大。献血者献血间隔要求为两周的单采血小板和献血间隔为半年的全血相比较，在感染病毒窗口期献血的几率，前者要远远大于后者。NAT检测效能与献血者献血间隔呈反比，对于献血间隔要求较短的单采血小板捐献者实施NAT,其检测效能尤为突出。因此，NAT检测效能的影响因素不仅与检测灵敏度相关，还和献血者献血间隔相关。

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