牛奶发酵过程中蛋白质的变化

张梵迪 陈新欣 姚凯勇

（浙江大学10级 1.农学院植物保护专业 2.动物科学学院动物科学专业3.动物科学学院动物医学专业）

引言：酸奶是我们生活中常见的饮品，由牛奶发酵而成。发酵过程使奶中糖、蛋白质有20%左右被水解成为小的分子（如半乳糖和乳酸、小的肽链和氨基酸等）。奶中脂肪含量一般是3%-5%。经发酵后，乳中的脂肪酸可比原料奶增加2倍。这些变化使酸奶更易消化和吸收，各种营养素的利用率得以提高。酸奶由纯牛奶发酵而成，除保留了鲜牛奶的全部营养成分外，在发酵过程中乳酸菌还可产生人体营养所必须的多种维生素，如VB1、VB2、VB6、VB12等。

我们实验小组研究的是在牛奶发酵过程中蛋白质分解状况。由于制成的酸奶是乳状液，蛋白质难溶于其中，因此很难直接测定其中的蛋白质。我们就先把蛋白质分离出来，测剩下溶液中的小分子物质含量变化，从而来比对蛋白质的分解程度。蛋白质是两性化合物，当PH达到酪蛋白（牛奶中主要蛋白质是酪蛋白）等电点4.8时，蛋白质所带正、负电荷相等，呈电中性，此时酪蛋白溶解度最小，从溶液中析出。

对于溶液中肽链和小分子物质的检测，我们采用的是Tricine-SDS-PAGE电泳的方法。在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。十二烷基磺酸钠（SDS）能与蛋白质的结合，改变蛋白质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比。在SDS-PAGE中，SDS-复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，用此方法我们即可鉴别出小分子的种类以及其相对分子量。

实验材料及仪器

材料

高蛋白脱脂奶粉 75g； 蔗糖 25g； 市售酸奶 250ml； 乙酸—乙酸钠缓冲溶液 100ml；

12%SDS，6%巯基乙醇，30%甘油，0.05%考马斯亮蓝， 150mM Tris/HCL（ph=7），

CH3OH，Tris，Gly，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，TEMED；

仪器

高压灭菌锅；烧杯；试管；烧瓶；玻璃杯；移液管；水浴锅；恒温箱；冰箱 —4℃；离心机；电泳槽；电泳仪；培养皿；

实验步骤 一．酸奶发酵

1. 配置酸奶

用3包共75克高蛋白脱脂奶粉和热水配置成450ml奶粉溶液。冷却后的酸奶迅速加入发酵剂和蔗糖。蔗糖共加入22.5克，发酵剂用的是市售酸奶。奶粉溶液均分成三分，分别加入1:1，1:5，1:10由市售酸奶勾兑的发酵剂，分为1，2，3号。 2. 消毒

把所有要用到的试管、玻璃棒、大小烧杯、移液管、漏斗等用牛皮纸包裹，放入高压灭菌锅灭菌30分钟。 3. 发酵

发酵前取样一次，记为1.1、1.2、1.3。发酵需要控制的是发酵环境的温度，发酵温度在42~~43°C牛奶逐渐凝固并产生芳香成分丁二酮；随着时间的推移，保加利亚乳杆菌开始生长并产酸，酸的产生促进了嗜热链球菌分解牛乳中的蛋白质产生氨基酸和风味物质乙醛。将加入发酵剂的原料乳倒入杯中，在恒温培养箱中静止培养，发酵终点的确定会影响酸奶的风味和组织状态。当酸奶的酸度达到60~70°T，同时观察酸奶的流动性和组织状态，如流动性变差，且有小颗粒出现，即可终止发酵。实验具体操作中的发酵终点的判断为形成豆腐状的半凝固状态，有少许乳清析出。途中，每隔一小时，取样一次(一共3次），依次记为2.1、2.2、2.3；3.1、3.2、3.3；4.1、4.2、4.3。将所有样品均15000转离心5min，取得其上清液。 4. 分光度的测量

为了大致了解牛奶中蛋白质浓度，并且假设其蛋白质中大部分都是酪蛋白，我们用Folin-酚法测定了其蛋白质浓度，并用酪蛋白标准曲线测得其蛋白质浓度。

二．等电点法酪蛋白去除

1. 配置 pH为4.7的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。因为在实验室没找到乙酸钠，我们采用乙酸酐与氢氧化钠以物质的量1：1混合。

2. 将100 mL牛奶和100 mL pH为4.7的乙酸-乙酸钠缓冲溶液加热至40-45℃，在搅拌下将缓冲溶液慢慢分别加至编号为1.2、2.2、3.2、4.2的试管中，直到pH值达到4.7，可用PH计检查，此过程应保持温度在40-45℃。将上述悬浊液冷却至室温，离心15min(10000r/min),保留上清液，弃去沉淀（酪蛋白）。分别把1.2、2.2、3.2、4.2的试管记为1、2、3、4，再发酵两星期后，从1:5中取样，离心15min(10000r/min)两次，将样品取得上清液，标记为5号。

3. 烘干。将制取的1.1,1.2,1.3,2.1,2.2,2.3,3.1,3.2,3.3,4.1,4.2,4.3样品的酪蛋白在烘箱中干燥12h后，称量上述9试管中5ml酸奶的制得的酪蛋白质量。

试管号 酪蛋白

1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 0.202 0.199 0.200 0.197 0.199 0.193 0.195 0.198 0.197 0.189 0.185 0.194

三．Tricine-SDS-PAGE小分子量电泳

1.按照我们的要求配置缓冲溶液，一共10种，具体配置要求如下： 缓冲溶液A：12%SDS，6%巯基乙醇，30%甘油，0.05%考马斯亮蓝，150mM Tris/HCL（ph=7） 缓冲溶液A/4：一份缓冲溶液A兑三分水

缓冲溶液C：12%SDS，6%巯基乙醇，0.05%考马斯亮蓝，150mM Tris/HCL（ph=7） 缓冲溶液B：12%SDS，30%甘油，0.05%考马斯亮蓝，150mM Tris/HCL（ph=7） 缓冲溶液B/4：一份缓冲溶液B兑三分水

缓冲溶液D：12%SDS，0.05%考马斯亮蓝，150mM Tris/HCL（ph=7） 转移缓冲液：3.03g Tris+14.42g Gly+200mL CH3OH 配成1L

2. 按照要求配置电泳所需的凝胶

AB-3 储存液(49.5%T,3%Cmixture):LowBis

24g丙烯酰胺+0.75g甲叉双丙烯酰胺 加H20定容至50ml,过滤4℃保存。，体积会扩大1/3 AB-6储存液(49.5%T,6%Cmixture):HighBis

23.25g丙烯酰胺+1.5g甲叉双丙烯酰胺 加H20定容至50ml,过滤4℃保存。体积会扩大

3. 安装电泳槽与灌胶

将所配凝胶沿着凝胶腔的长玻璃板内面缓慢用滴管滴入，小心不要产生气泡；将胶液加到距短玻璃板上沿2-3cm处为止；再沿内壁缓慢注入蒸馏水或正丁醇进行水封，静置进行聚合反应，待水和胶之间出现明显界线为止。倒去水封层，用滤纸吸去残留水液，加入浓缩胶，将梳子轻轻插入胶液顶部，静置聚合。 4. 样品处理

在每个样品取15μL蛋白质溶液加入5μL 缓冲溶液A。 5. 加样

在垂直型电泳装置的两个半槽内分别加入电泳缓冲液，上面的半槽内加入阴极缓冲液，在电泳槽底部加入征集缓冲液。用微量注射器取样品混合液5-10ul，加在各个样品槽内。 共10个槽，加样分别为： 1 10ul5号 2 10ul4号 3 10ul3号 4 5ul4号 5 marker 6 5ul3号 7 10ul2号 8 5ul2号 9 10ul1号 10 5ul1号 6. 电泳

30V,80mA电泳，当染料从积层胶进入分离胶后，电压加到90V,继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源停止电泳。 7. 固定

电泳结束后，取下凝胶模，用专用铲子撬开短玻璃板，将凝胶一角切下做一加样标记。将凝胶放入转移缓冲液中进行固定。 8. 染色

将凝胶板放在培养皿内，加入染色液（考马斯亮蓝），晃荡，染色30min左右。 9. 脱色

弃去染色液，加入蒸馏水漂洗数次。再加入脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰为止。

讨论

1.加入过硫酸铵量过少，胶版凝结不彻底。 2.应使用AB-6，我们使用了AB-3。

3.温度低导致凝胶缓慢，凝胶时时间不够，未等胶版老化就灌入上层胶。