红色红曲菌液态发酵产胞外淀粉酶的研究

红色红曲菌液态发酵产胞外淀粉酶的研究　陈彬　，唐建忠　，王轩　，周立平　（１．浙江工业大学，浙江杭州３１００１４；　２．晨光生物科技集团股份有限公司，河北省天然色素工程技术研究中心，河北曲周０５７２５０）　摘要：通过对红曲菌胞外淀粉酶活力的检测初步研究了红色红曲菌液态发酵产淀粉酶的特性。研究表　明，红色红曲菌在液态发酵培养过程中分泌的胞外淀粉酶主要为葡萄糖淀粉酶，产酶时间略提前于红曲菌菌　丝体生长高峰期，在培养第２天达到最高值。葡萄糖淀粉酶分泌的最适碳源为６％淀粉，最适氮源为２％蛋白　胨，发酵最适条件为３２￣Ｃ，初始ｐＨ６，接种量５％。红曲菌产葡萄糖淀粉酶的较佳培养条件与红曲菌较适生　长条件基本相符。红曲菌在液态发酵过程中几乎不产胞外　一淀粉酶。无论是固态培养还是液态发酵，红色　红曲菌的产淀粉酶能力均低于紫色红曲菌。　关键词：红色红曲菌；葡萄糖淀粉酶；ｏ【一淀粉酶；液态发酵　中图分类号：ＴＳ２０１．２＋５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６～２５１３（２０１１）０１—００７７—０５　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｍｙｌａｓｅｓ　ｉｎ　ｌｉｑｕｉｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｒｕｂｅｒ　ＣＩ－ＥＮ　Ｂｉｎ　，ＴＡＮＧ　Ｊｉａｎ．ｚｈｏｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｘｕａｎ　，ＺＨＯＵ　Ｌｉ－ｐｉｎｇ　（１．Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３　１００１４，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｃｈｅｎｇｕａｎｇ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｉｇｍｅｎｔ　Ｇｒｏｕｐ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｈｅｂｅｉ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｉｇｍｅｎｔ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｅｂｅｉ　Ｑｕｚｈｏｕ　０５７２５０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｍｙｌａｓｅｓ　ｌｉｑｕｉｄ—ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｂｙ　Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｒｕｂｅｒ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａｍｙｌａ・　ｓｅｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｍｙｌａｓｅ　ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｂｙ　Ｍｏｎａｓｅｕｓ　ｔｕｂｅｒ　ｉｎ　ｌｉｑｕｉｄ—ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｇｌｕｃｏａｍｙ—　ｌａｓｅ，ｗｈｉｃｈ　ｒｅａｃｈｅｄ　ｉｔｓ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｄａｙ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｔｉｍｅ　ｉｓ　ｓｌｉｇｈｔｌｙ　ａｈｅａｄ　ｏｆ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｇｒｏｗｔｈ　ｔｉｍｅ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　Ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｆｏｒ　ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｗａｓ　６％ｓｔａｒｃｈ：ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｗａｓ　２％ｐｅｐｔｏｎｅ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｗａｓ　ａｔ　３２℃ｗｉｔｈ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｐＨ　６．ａｎｄ　５％ｉｎｏｃｕｌｕｍ．Ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ＷａＳ　ａｓ　ｓｉｍｉｌａｒ　ａｓ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｇｒｏｗｔｈ．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｌｉｑｕｉｄ—ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．仅　一ａｍｙｌａｓｅ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ，ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｙｌａｓｅ　ｂｙ　Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｔｕｂｅｒ　ｗａｓ　ｌｏｗ—　ｅｒ　ｂｏｔｈ　ｉｎ　ｓｏｌｉｄ　ｓｔａｔｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｎ　ｌｉｑｕｉｄ—ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｒｕｂｅｒ；ｇｌｕｅｏａｍｙｌａｓｅｓ；　一ａｍｙｌａｓｅ；ｌｉｑｕｉｄ—ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　红曲菌在生长过程中能产生多种酶，如淀粉　酶、糖化酶等能将淀粉水解形成糊精、低聚糖和　酶、糖化酶、糊精化酶、蛋白酶等，因此，可以　葡萄糖等低分子物质，可改善制品的风味；蛋白　用于淀粉类食品或肉类制品生产过程：其淀粉　酶能将蛋白质分解成多肽、氨基酸等小分子化合　收稿日期：２０１０—０９—３０　通讯作者　作者简介：陈彬（１９８４一），男，汉族，浙江温州人，在读硕士，研究方向：微生物发酵工程。　Ｃｈｉ史垦盒照鋈垫　ｎａ　Ｆｏｏａ　Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ　试验研究　物，使制品组织细腻、口感滑爽、香味浓郁、色　泽红润，故可用红曲腌渍鱼、肉、豆腐等高蛋白　食品　］。不同种类菌株产酶的类型及产量有所差　异。一般来说，液化型仅一淀粉酶活性较弱，而　糖化型的葡萄糖淀粉酶活性较强　Ｊ。红曲菌在液　态发酵过程中分泌的各种酶直接或间接参与了菌　体的生长及各种初级或次级代谢产物的生产，因　此研究红曲菌生长过程中产生的相关胞外酶对改　善红曲菌发酵工艺有着重要的参考价值。　１材料和方法　１．１　菌种　红曲菌　ＧＭＡ４　（　ｒｕｂｅｒ）、ＳＭ００５　（　ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）由浙江工业大学发酵工程研究所　保藏。　１．２培养基　斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基　种子培养基：葡萄糖３％，蛋白胨３％，　ＫＨ２ＰＯ４０．１％，ＮａＮＯ３０．２％，ＭｇＳＯ４０．１％，乳酸　调ｐＨ４．５，１２１２２灭菌２０ｍｉｎ，备用。　发酵培养基：可溶性淀粉６％，蛋白胨ｌ％，　酵母粉１％，ＮａＮＯ３０．２％，ＭｇＳＯ４０．１％，乳酸调　ｐＨ４．５，１２１２２灭菌２０ｍｉｎ，备用。　大米固态培养基：大米培养基加５％葡萄糖，　３％蛋白胨，初始含水量控制在５０％左右，乳酸　调ｐＨ　４．５，１２１２２灭菌５０ｒａｉｎ，备用。　１．３主要仪器设备　ＲＬＨ一２５０Ａ型生化培养箱；超净工作台；　ＨＹＧ—ＩＩＩ旋转式恒温调速摇瓶柜；ＨＨ一２型水浴　锅，９８一Ｉ—Ｂ型电子调温电热套等。　１．４方法　１．４．１红曲菌培养　孢子悬液制备：从斜面挑取孢子至无菌水　中，用玻璃珠打散使孢子浓度达到０．５×１０　个／　ｍＬ。　种子培养：２５０ｍＬ三角瓶装液５０ｍＬ，接种孢　子悬液５ｍＬ，３２２２，１８０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２ｄ。　摇瓶培养：５００ｍＬ三角瓶装液１００ｍＬ，按　５％接人种子液，３２２２，１８０ｒ／ｍｉｎ摇床培养１０ｄ。　大米固态培养：５００ｒｎＬ三角瓶装大米１００ｇ，　按２０％接人种子液，３２℃培养３０天。　１．４．２菌丝体的测定　发酵液用３层纱布过滤，再用蒸馏水洗涤２　～３次，拧干水分，在６０２２烘箱中烘干至恒重，　即为菌丝干重。　１．４．３胞外淀粉酶活力的检测　（１）　一淀粉酶活力的检测：　吸取２５ｍＬ　２０ｇ／Ｌ可溶性淀粉液，加　５ｒａＬｐＨ４．６缓冲液于１００ｍＬ试管中，６０２２水浴　１０ｒａｉｎ，加入５ｍＬ提取的粗酶液，充分摇匀，立　即计时。６０２２保温，定时取出一滴反应液加入ｃ　（１／２Ｉ　）：０．１Ｍ碘液，当碘液颜色不再改变时为　反应终点，记录液化时问ｔ　ｍｉｎ。　仅一淀粉酶活力的定义：１ｍＬ粗酶液于６０２２、　ｐＨ４．６条件下，以１ｈ液化可溶性淀粉的质量来表　示　ｊ。　（２）葡萄糖淀粉酶活力的检测：　吸取２５ｍＬ２０ｇ／Ｌ淀粉液于５０ｍＬ容量瓶，加　ｐＨ４．６缓冲液５ｍＬ，４０２２水浴１０ｒａｉｎ，加５ｍＬ提　取的粗酶液，混匀立即计时。４０２２保温１ｈ，迅速　加入１５ｍＬ　０．１Ｍ　ＮａＯＨ，冷却至室温，水定容至　５０ｍＬ，摇匀。用菲林试剂检测反应液中葡萄糖含　量　。　葡萄糖淀粉酶活力定义：１ｍＬ粗酶液在４０２２　ｐＨ４．６条件下１ｈ内酶解可溶性淀粉生成１ｍｇ葡　萄糖定义为一个酶活力单位，Ｕ／ｍＬ。　２结果与讨论　２．１胞外淀粉酶活力的检测　在以淀粉为生长碳源和能源的微生物中，他　们能利用本身合成并分泌到胞外的淀粉酶将淀粉　水解生成双糖和单糖后被微生物吸收，然后再被　分解利用　Ｊ。本文检测红色红曲菌的胞外淀粉酶　主要为　一淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。　２．１．１　一淀粉酶活力的检测　一淀粉酶以随机方式从淀粉分子内部水解　一１，４糖苷键，作用结果是产生麦芽糖，含有６　个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖　ｊ。本实　验连续ｌ２天取样检测红曲菌ＧＭ０１１产仅～淀粉　酶的活力，均未检出其活力大小，由此说明　ＧＭ０１１产仅一淀粉酶的活力较低或不产仅一淀粉　酶。这与大多数文献报道一致　卜　。　如　加　ｍ　０　一＿ＩⅧ册　∞　２．１．２葡萄糖淀粉酶活力的检测　２．１．２．１发酵周期对葡萄糖淀粉酶活力的影响　由图１可以看出，红色红曲菌ＧＭＡ４的葡萄糖淀　由图２所示，淀粉做碳源时葡萄糖淀粉酶的　活力最高，达到４０．９Ｕ／ｍＬ，添加此碳源时菌体　生长所达到的生物量也最高。说明葡萄糖淀粉酶　粉酶活力在第２天达到最大值，比生物量达到最　大值的时问提前一天，说明红曲菌分泌葡萄糖淀　粉酶是为了能更好的分解淀粉，吸收葡萄糖以合　是一种诱导酶，红曲菌在淀粉或大米粉的诱导下　能产生较多的葡萄糖淀粉酶用以分解培养基中的　淀粉，并加以吸收利用。较高的淀粉酶有利于菌　成菌体，满足自身生长代谢。　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　发酵时间（ｄ）　图１发酵周期对葡萄糖淀粉酶活力的影响　２．１．２．２碳源对葡萄糖淀粉酶活力的影响不同　碳源和氮源的添加，会导致红曲菌生长情况和初　级次级代谢产物的分泌量存在较大的差异，其原　因可能是因为在不同碳氮源下红曲菌分泌的胞外　水解酶含量不同，影响菌体对营养物质的分解吸　收。考察不同碳源对ＧＭＡ４所产葡萄糖淀粉酶活　力的影响，添加量为６％，氮源为２％蛋白胨。　１４　１２　—　１０　一　８删　６划　４　２　０　１　２　３　４　５　６　７　１大米粉２淀粉３糊精４葡萄糖　５大米粉／葡萄糖６淀粉／葡萄糖７糊精／葡萄糖　圈２碳源对葡萄糖淀粉酶活力的影响　体的生长。　２．１．２．３氮源对葡萄糖淀粉酶活力的影响考察　不同氮源对菌体分泌葡萄糖淀粉酶的影响，结果　由图３所示，添加量为２％，碳源为６％淀粉。添　加不同的氮源后葡萄糖淀粉酶的活力基本一致，　可知不同氮源对红曲菌产葡萄糖淀粉酶的影响不　大。相对而言，采用蛋白胨作为氮源所产生的葡　萄糖淀粉酶活力和生物量较高，分别达到２１．５Ｕ／　ｍＬ和９．５　Ｌ。　（１ｕｖｎ）　螵龆　冀婶鼯　加　ｍ　５　０　ｌ４　ｌ２　１０　ｓ要　蓊　４　２　０　１　２　３　４　５　１蛋白胨２蛋白胨／酵母粉３酵母粉４黄豆饼粉５玉米浆　图３氮源对葡萄糖淀粉酶活力的影响　２．１．２．４发酵温度对葡萄糖淀粉酶活力的影响　图４所示为发酵温度对葡萄糖淀粉酶活力的影响，　碳源为６％淀粉，氮源为２％蛋白胨。在发酵过程　特别是产酶过程中，为了保持酶的最高活性，温　度不宜过高。红曲菌在３２￣Ｃ培养所产葡萄糖淀粉　酶活力最高，超过３２ｃ（＝后酶活降低，其原因为过　高的温度使红曲菌生长受到影响，葡萄糖淀粉酶　的分泌量和活性受到抑制。　２．１．２．５初始ｐＨ值对葡萄糖淀粉酶活力的影响　图５所示为初始ｐＨ值对红曲菌分泌的葡萄糖　淀粉酶活力的影响，在ｐＨ值３到６范围内，淀　（１ｍ／已　呈６凝鑫　赣精舔　粉酶所受到的影响较小，活力略呈现上升趋势，　∞　∞　ｍ　条件，采用正交设计实验，对液态发酵培养基条　件进行进一步优化。实验设计及结果见表１。　０　在ｐＨ值为６时活力达到最大，ｐＨ值高于６之　后，淀粉酶活力开始下降。可以判断本株红曲菌　在酸性培养基中能较好地分泌葡萄糖淀粉酶分解　吸收淀粉，在ｐＨ４～６范围产淀粉酶活性较为稳　定，说明该株红曲菌有较大的ｐＨ适应范围。　初始ｐＨ值　（１ｕｖ　一　呈｝盛　２４　婆婷糖　３２　图５初始ｐＨ值对葡萄糖淀粉酶活力的影响　３４　∞　２６　∞　２８　加　３０　ｍ　Ｏ　发酵温度（℃）　矗一　１４　图４发酵温度对葡萄糖淀粉酶活力的影响　邑１２　２．１．２．６接种量对葡萄糖淀粉酶活力的影响　由　．　图６所示，当接种量达到５％时，红曲菌产生的葡　萄糖淀粉酶活力达到最高，接种量增加后酶活力随　。　稳一一　４　％一　之下降，可能是接种量过大或过小均影响菌体生　长，阻碍了淀粉酶的分泌。接种量过小，发酵启动　时问变长，生长缓慢，而接种量过大，菌体积累过　快，营养被迅速消耗，皆不利于淀粉酶的合成。　２．１．３正交设计确定红色红曲菌较佳产酶条件　轻　４％　５％　７％　９％　１０％　接种量　为进一步确定ＧＭＡ４产葡萄糖淀粉酶的发酵　图６接种量对葡萄糖淀粉酶活力的影响　表１正交试验结果　实验号　１　Ａ（淀粉）／％　６　６　Ｂ（蛋白胨）／％　１．５　２　酶活力Ｕ／ｍＬ　３８．７　４０．４　３９．４　６　４　７　２．５　１．５　２　２．５　１．５　２　３８．９　７　６　７　３８．５　３８．８　４０．１　３９．１　３７．６　８　８　８　８　１．５　３９．２　３９．５　３８．７　３９．３　３８．６　３８．９　Ｏ．８　Ｏ．７　由表１可得出：以酶活为观测值，确定红曲　菌发酵最佳水平为：Ａ　Ｂ：Ｃ　Ｄ　，影响因素大小为　Ｄ＞Ａ＞Ｂ＞Ｃ。即最佳发酵条件为：淀粉６％，蛋　白胨２％，ｐＨ６，接种量５％。　２．２红色红曲菌ＧＭＡ４与紫色红曲菌ＳＭＯｏ５产　淀粉酶能力的比较　比较了红色红曲菌ＧＭＡ４（以产ＭｏｎａｃｏｌｉｎＫ　符，说明胞外淀粉酶与红曲菌菌体生长相关。　ＧＭＡ４红曲菌在液态发酵过程中不产胞外Ｏ／．一淀　粉酶，因此在以大米或淀粉为主要碳源的发酵培　养基中可考虑适当添加仅一淀粉酶以有助于红曲　菌对基质的利用。与色素红曲菌相比，功能红曲　菌由于葡萄糖淀粉酶活力较低，发酵初期生长较　慢，易受杂菌污染，用通风曲池发酵存在较大局　为主）与紫色红曲菌ＳＭ００５（以产色素为主）固　限，目前只能采用小体积封闭式的培养方法。　态发酵和液态发酵产　一淀粉酶和葡萄糖淀粉酶　的能力。结果发现无论是固态还是液态发酵，两　参考文献：　者均为检测出仅一淀粉酶，说明两者均不产仅一　［１］张菲菲．红曲菌应用研究进展［Ｊ］．酿酒科技，２００９，　淀粉酶或仅一淀粉酶含量很低。红曲菌ＧＭＡ４经　（７）：９１—９４．　液态发酵产生的葡萄糖淀粉酶最高达到４０．１Ｕ／　［２］索江华，黄现青，郭爽．红曲霉及其主要产物［Ｊ］．郑州牧　业工程高等专科学校学报，２００６，２６（１）：２１—２３．　ｍＬ，固态发酵在第２８天达到最高值４８５．４Ｕ／ｇ，　［３］彭志英．食品酶学导论［Ｍ］．北京：轻工业出版社，２００１．　红曲菌ＳＭ００５经液态与固态发酵酶活力分别达到　１２４—１２６．　６５Ｕ／ｍＬ和１６０２．８Ｕ／ｇ，皆高于ＧＭＡ４。色素红曲　［４］大连轻工业学院等八所院校合编．食品分析［Ｍ］．北京：　菌淀粉酶活力高于功能红曲菌，使得发酵初期菌　轻工业出版社，１９９４．１９１—１９３．　体能够更快利用基质进行生长，这可能就是色素　［５］魏培莲．土曲霉固态发酵产洛伐他汀的关键技术和新工艺探　索［Ｄ］．杭州：浙江大学材料与化学工程学院，２００７．　红曲抗杂菌能力优于功能红曲，适合通风曲池发　［６］武汉大学、复旦大学生物系微生物学教研室．微生物学　酵，而功能红曲只能采用小体积封闭式培养方　［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９８７．１９４．　法　的主要原因之一。　［７］童群义．红曲霉产生的生理活性物质研究进展［Ｊ］．食品科　学，２００３，２４（１）：１６３—１６７．　［８］任仙娥，张水华，王启军，等．色素红曲霉和降脂红曲霉主　３　结论　要胞外酶系的比较研究［Ｊ］．中国调味品，２００５，（５）：２６　红色红曲菌ＧＭＡ４在液态发酵培养过程中分　—３Ｏ．　泌的胞外淀粉酶主要为葡萄糖淀粉酶，产酶时间　［９］林赞峰．红曲的传统工艺与最新发展［ｃ］．９４国际酒文化　略提前于红曲菌菌丝体生长高峰期，在培养第２　学术研讨会论文集，杭州：浙江工业大学出版社，１９９４．３３　—３９．　天达到最高值。葡萄糖淀粉酶分泌的最适碳源为　［１０］林长勇．古田红曲的历史与生工艺［ｃ］．９４国际酒文学术　６％淀粉，最适氮源为２％蛋白胨，发酵最适温度　研讨会论文集，杭州：浙江工业大学出版社，１９９４．４０—　３２￣Ｃ，初始ｐＨ６，最适接种量５％。葡萄糖淀粉　４３　酶的较佳培养条件与红曲菌较适生长条件基本相