抗流感药物靶点及其抑制剂

抗流感药物靶点及其抑制剂

流感病毒是一种负螺旋单链RNA病毒，属于正黏病毒科。根据病毒核蛋白（nucleoproteins，NP）及基质蛋白（matrix proteins，M1）的抗原决定簇不同，流感病毒被分为三类：甲型（A）、乙型（B）、丙型（C）。流感病毒颗粒结构大致相似（如图1），自内而外可分成核心、基质蛋白以及包膜三部分。病毒子通常呈圆形，长丝状。甲型和乙型流感病毒核酸有八个RNA节段，负责编码十种蛋白，包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、酸性蛋白（PA）、碱性蛋白1（PB1）、PB2、核蛋白（NP）、基质蛋白（M1）、离子通道蛋白（M2）、非结构蛋白（NS1）、核输出蛋白（NEP或NS2）。此外，大多数甲型流感病毒还有线粒体靶向的寡聚PB1-F2蛋白[1]，报道其与细胞凋亡以及病毒毒力有关。这些病毒RNA片段同NP结合并缠绕形成病毒核糖核蛋白体（vRNP），vRNP再与三聚的RNA聚合酶（PA、PB1、PB2）结合形成核糖核苷酸，负责RNA的复制和转录，这种结合模式确保了病毒RNA对于核酸酶保持敏感。丙型流感病毒只有七个RNA节段。基因组分节段的特点为流感病毒高频率基因重配提供了条件。病毒核心被外部的脂蛋白膜包围，在脂膜上有基质蛋白M1，其是病毒颗粒的主要蛋白，并通过化学键结合到vRNP。M2蛋白为具有离子通道活性的跨膜蛋白。乙型流感病毒缺乏M2蛋白，但是一种叫做BM2的蛋白可以起到类似M2蛋白作用。病毒最外层的包膜是包裹基质蛋白的磷脂双分子层，该膜来源于宿主细胞的细胞膜。膜表面具有两类非常重要的“刺突”，即两种糖蛋白，HA和NA。乙型流感病毒表面抗原相对简单，仅有一种HA和一种NA。对于甲型流感，根据病毒表面抗原HA及NA的不同，其可进一步细分为16个HA亚型（H1 ～ H16）、9个NA亚型(N1 ～ N9)[2]。

图1 甲型流感病毒结构模式图[3]

三种类型流感病毒的宿主范围也是有区别的：甲型流感病毒能够感染哺乳类动物（人、猪、马等）和禽类，乙型流感病毒主要在人类和猪间传播，丙型流感病毒只在人类传播。另外，三种病毒的变异性及危害性从大到小依次是甲型、乙型、丙型，因此，对人类危害性最大的是甲型流感病毒。

流感病毒感染及增殖过程

图2 流感病毒感染及增殖机制[4]

如图2所示，流感病毒感染及增殖过程可大致分为黏附→内吞→融合→去包膜→入核→vRNA合成→蛋白合成→出核→组装→出芽→释放等阶段。

首先，流感病毒包膜表面抗原HA识别并粘附到宿主细胞膜表面糖脂或糖蛋白上的唾液酸（sialic acid，SA）受体上，在粘附阶段，神经氨酸酶的唾液酸酶活性阻止HA与气管上皮细胞粘液层唾液酸的结合，从而强化病毒感染。接着，在受体介导的细胞内吞作用下，结合于宿主细胞表面的病毒进入宿主细胞并形成胞内体（endosome）。胞内体内的低pH条件启动HA“融合域”构象转化，导致病毒包膜与胞内体膜发生融合。与此同时，非糖基化基质蛋白M2离子通道被激活，形成进入细胞内膜的内向质子流，引发基质蛋白M1与vRNP的解离。然后，vRNP被转运进入细胞核，启动病毒遗传信息的复制和转录。RdRP以及NP对流感病毒的转录和复制具有重要意义。新合成的NP以及RNA聚合酶也被转入细胞核，与新和成的vRNA结合形成子代vRNP。在非结构性的核输出蛋白NEP/NS2及基质蛋白M1介导下，核内形成的子代vRNP被转运出宿主细胞核进入细胞浆，经装配形成成熟病毒颗粒。出芽后的新病毒颗粒仍然通过HA-SA键吸附于宿主细胞表面，经NA水解SA释放子代病毒，造成病毒的扩散与传播[5]。

抗流感病毒靶点及其抑制剂

预防和治疗流感，通常采用疫苗和抗流感化学药物。流感病毒不断地变异，常规疫苗可能难以预防治疗新病毒引发的流感大爆发，因此，抗流感化学药物研究具有非常重要的意义。总的来说，目前的抗流感化学药物有两个大的研究方向，分别针对流感病毒本身功能蛋白和宿主细胞潜在靶点。

基于宿主的抗流感病毒靶标及抑制剂

基于宿主的抗流感病毒靶标包括蛋白酶和囊泡质子ATP酶以及激酶等，然而这类药物对于非感染组织的潜在毒性还有待评价。

（1）蛋白酶 前体蛋白HA0剪切位点的性质决定了能够剪切HA0的宿主蛋白酶类型，直接影响病毒嗜组织性和致病力。在高致病性H5和H7禽流感病毒中，HA0剪切位点含有多碱基序列，可被宿主细胞内广泛存在的碱性氨基酸蛋白酶或者PC6蛋白酶剪切，引起鸟类致死性的全身感染[6, 7]。然而，在一般的甲型流感病毒中，蛋白酶剪切位点表达的是单个精氨酸残基，只能被内蛋白酶识别，同时这种蛋白酶仅在鸟类肠道以及鸟类与哺乳动物的呼吸道中表达，极大地限制病毒在宿主体内的传播[8, 9]。事实上，如图3所示，已知的蛋白酶抑制剂，包括萘莫司他（Nafamostat）、卡莫司他（Camostat）等，均对甲、乙型流感病毒表现出较好的体内外选择性抑制作用[5]。

图3 蛋白酶及V-ATPase抑制剂

（2）囊泡质子ATP酶（V-ATPase） 选择性V-ATPase抑制剂通过升高前溶酶体内部pH，从而抑制HA从非融合构象向融合构象的转化，进而实现病毒复制的抑制。针对该靶点的化合物有1994年报道的Norakin（如图3）。

针对流感病毒自身功能蛋白的靶点及抑制剂

该类化学药物根据病毒作用部位不同，可分为三大类，分别针对病毒核心（RdRP、NP）、病毒基质蛋白（M2）、病毒包膜突触（HA、NA），下面就它们的抑制剂作简单介绍。

（1）RdRP 流感病毒RdRP进化中高度保守，与哺乳动物的RNA聚合酶完全不同，流感病毒RdRP同时具有复制酶和核酸内切酶活性。感染早期阶段，RdRP以vRNA为模板合成mRNA，具有转录功能；病毒感染晚期，RdRP构象转变，以vRNA为模板合成互补的cRNA，再以合成的cRNA为模板合成vRNA,从而实现复制功能。RdRP由异三聚的PA、PB1、PB2三个亚基构成，也称为3P复合体。

PB1位于3P复合体的核心，其N端和C端分别与PA亚基的C端、PB2亚基N端相连，形成稳定蛋白复合物。PB1亚基通过不同构象结合vRNA或cRNA，分别合成mRNA（或cRNA）、vRNA，从而履行转录、复制功能。其构象的转换也是PB2帽子结合位点与内切酶活性位点激活的一个原因[10]。如图4所示，化合物A是近年报道的靶向PB1的化合物，其IC50值为0.5 µM[11]。

PB2亚基具有多重功能。首先，PB2亚基318-483位氨基酸残基区域能够与宿主mRNA引物帽结构结合[12]，从而启动转录过程。其次，PB2亚基C端678-757位氨基酸残基区域存在二重核定位信号（NSL），与RNA聚合酶通过核孔转运至细胞核内有关。第三，PB2亚基能够增强聚合酶复合物的稳定性，这可能是PB2亚基能够增强流感病毒对外界温度适应性的原因[13]。最后，研究发现PB2亚基R702、K627分别与病毒宿主选择性[14]、致病性[15]有密切关系。如图4所示，化合物B为近年报道的靶向PB2的化合物，其抑制A/H3N2的IC50为7.5 µM[16]。

图4 RdRP的

抑制剂

PA也是3P复合体一个非常重要的亚基。Yuan[17]和Dias[18]分别在Mg2+、Mn2+存在下，获得了PA亚基N末端的晶体结构，验证了PA亚基内存在核酸内切酶活性位点，也表明该核酸内切酶具有双离子介导的作用机制。其次，PA亚基为磷酸化蛋白，1～247位氨基酸残基区域是其介导蛋白质水解的功能区，其水解活性与聚合酶活性呈正相关[19]。再者，PA亚基也能够与vRNA、cRNA启动子特异性结合，163～178位氨基酸的突变，导致PA亚基与cRNA结合力降低，聚合酶活性的抑制[20]。另外，PA亚基124～139及186～247两个氨基酸残基区域存在两个核定位（NSL）信号，这与PB1亚基穿核运输及核内聚集相关[21]。2008年，通过共沉淀结晶的方法，He等[22]获得了H5N1亚型AIV的PAC-PB1N蛋白复合物的晶体结构，由于二者相互作用的残基在甲型流感中高度保守，这为新一代抗流感药物的设计提供了新靶标。2012年，Muratore[23]通过虚拟筛选发现图 4所示化合物C，其可以干扰PA、PB1蛋白正确结合，其抑制病毒斑形成的ED50为20 µM左右。2013年，Massari[24]报道了化合物D，也是PAC-PB1N相互作用抑制剂，结构如图 4所示，其对A/H1N1亚型AIV的EC50一般为20 µM。2014年，Pagano[25]报道了两个化合物（如图 4所示化合物E、F），其抑制A/H1N1亚型AIV的IC50均为1 µM。

利巴韦林（Ribavirin）和Favipiravir（T-705）是两个核苷类的RdRP抑制剂（图 4），IC50值分别为6.8～37 µM、1 µM。前者很早就已上市，是一种广谱抗病毒药物，后者目前处于临床Ⅲ期（日本）。T-705是一种前药，代谢活化后，通过竞争性结合GTP抑制流感病毒RdRP。与Ribavirin比较，其不影响宿主DNA/RNA的合成，仅轻度抑制宿主次黄嘌呤核苷酸脱氢酶，高剂量下无显著细胞毒性，安全性更高。同时，T-705对NAI、M2I耐药病毒株也有效[26]。因此，T-705是一个具有很大市场潜力的药物。

（2）NP 核蛋白占病毒蛋白总量的30％，其N端含有一个RNA结合区域以及两个核蛋白-核蛋白相互作用区域。NP作为结构蛋白组成vRNP，与病毒宿主的特异性也有关，同时，参与病毒复制的多个阶段，包括：在双重核定位信号作用下，vRNP进入宿主细胞核过程；vRNA在宿主细胞核内的合成；通过与PB1和PB2的相互作用对多聚酶活性的调节；通过与M1/NS2相互作用对vRNP出核的调控。NP含有一种胞浆聚集信号，通过与丝状肌动蛋白相互作用，导致NP在病毒感染后期滞留在胞浆。2006年，Ye等[27]完成了对A/WSN/33流感病毒NP晶体结构的解析，揭示了NP尾环介导的NP聚合。不同亚型的A型流感病毒尾环的组成氨基酸进化中高度保守，其上30个氨基酸残基的单个突变就可导致NP聚合能力的完全丧失，因此，尾环上的结合口袋成为NP靶向抗流感药物的潜在靶点。2006年，香港大学袁国勇课题组[28]发现了名为nucleozin的小分子化合物，其靶向NP聚集,阻断NP转运入核,从而抑制H1N1、H3N2、H5N1亚型AIV的感染，证实了NP可作为抗流感靶点。2012年，丁克课题组[29]通过对nucleozin的改构，发现了化合物G（如图5），其针对各种H3N2、H1N1的IC50值的范围为0.5～4.6 μM，对金刚烷胺耐药的A/WSN/33(H1N1)、奥司他韦耐药的A/WSN/1933(H1N1,274Y)病毒株也有一定效果。该类化合物结构如图 5所示。

图 5 NP及HA的抑制剂

（3）M2 金刚烷胺、金刚乙胺为两个最具代表性的M2离子通道抑制剂，仅对甲型流感有效。这两个药物在临床上使用多年，耐药性问题突出。但是，这类药物能够促进外呼吸道扩张从而增加摄氧量，使得其在抗流感中仍然具有重要价值。耐药毒株氨基酸突变区结构的进一步阐明，为该类药物解决耐药问题提供了机遇[30, 31]。同时，针对A/M2及BM2蛋白进化高度保守区HXXXW开发抑制剂，有望得到对甲型、乙型流感均有效的药物[32]。

（4）HA 流感病毒进入靶细胞的过程需要酸性环境的诱导：在胞内体低pH条件下，HA构象改变，前体蛋白HA0经蛋白酶剪切形成HA1和HA2，暴露出隐藏在蛋白中的融合域，即HA2的疏水N端。HA2的N端插入胞内体膜，每三分子的HA2即形成六螺旋束形“融合孔”，使得病毒膜与胞内体膜融合，病毒基因组通过融合孔进入细胞质。而HAl负责与宿主细胞膜表面的唾液酸受体结合，介导病毒通过胞饮方式进入细胞形成胞内体。靶向HA的抗流感化合物，根据机制不同可分为两类：一类是阻止HAl与宿主细胞膜表面SA受体结合的黏附抑制剂，这类以fludase（DAS181）为代表，其是一种新型唾液酸酶融合蛋白，目前处于Ⅱb期临床（美国）；另一类是阻断HA2介导的膜融合过程的融合抑制剂（抑制低pH诱导的HA构象转化），这是人们研究较早的一类抑制剂，包括1997年报道的以BMY-27709为代表的水杨酰胺类、1998年报道的以stachyflin为代表的司他弗林类化合物。该类化合物结构如图 5所示。

（5）NA 1967年，一种神经氨酸酶类似物（DANA）被Meindl等合成，然而，其对NA的抑制活性并不显著，未能应用于抗流感治疗。1993年，伴随着神经氨酸酶晶体结构的解析[33]，von Itzstein[34]等对DANA进行了结构改造，除了环上取代基手性的调整，将DANA母核的4位羟基用碱性的胍基替代，得到了第一个临床使用的NAI——扎那米韦（zanamivir），其对NA的亲和力较DANA高100倍。但是，其口服生物利用度低，目前临床主要使用其吸入剂型。1997年，Kim等[35]用环己烯环替换扎那米韦的吡喃环，保证环上取代基空间伸展方向不变情况下，用疏水的3-戊氧基替代扎那米韦母环6位上连接的甘油基，将强碱性胍基用氨基替代，得到了奥司他韦（Oseltamivir）。该化合物于1999年被FDA批准用于临床。其能有效抑制流感病毒，同时，相对于扎那米韦，其口服生物利用度大大提升，固体口服给药途经增加了患者的依从性，是目前使用最广的NAI[35],这也导致了其耐药性积累速度最快。

目前临床使用较少的NAI还有在日本应用的帕拉米韦（Peramivir）以及拉尼那米韦（Laninamivir），其中拉尼那米韦属于目前唯一长效NAI。对于奥司他韦耐受，又不能喷雾吸入扎那米韦的患者，可以考虑静脉注射帕拉米韦；现有研究表明对于奥司他韦耐药的毒株，拉尼那米韦依然有效，同时拉尼那米韦一天只需服用一次，使得患者依从性更好[36]。

目前，从人、猪、禽类中分离的NAI耐药病毒株，包括了除N4亚型之外所有甲型流感病毒亚型以及乙型流感病毒。在流行的高致病性N1亚型（如H1N1、H5N1等）中，奥司他韦耐受问题最普遍，H274Y突变是导致其耐受的主要原因[37]。常见的N2亚型（主要为H3N2）耐药突变为E119V、R292K突变，但是H274Y突变并不能导致N2亚型对奥司他韦的耐药[37, 38]。乙型流感病毒对扎那米韦的耐药与R152K突变有关[39]，对奥司他韦的耐药与R317K突变相关[40]。

图 6列出了奥司他韦与NA催化区（以N8为例）结合模式，我们将结合区分为4个

亚位点。2002年，Hanessian[41]将奥司他韦母环5位氨基用乙烯基取代，成功得到了化合物H（Ki = 45 nM，本节所有讨论的NAI结构见图 8），探讨了NA催化区2号亚位点发生疏水相互作用而非电荷相互作用的可能性。2012年，Bhatt[42]继续对该位点改造，通过羟基、甲氧基、乙氧基、烯丙基取代的对比，发现还是羟基取代（化合物I）的活性最高(IC50 = 0.32 µM)。通过Hanessian和Bhatt的工作，我们发现NA催化区2号亚位点的氢键相互作用对于NAI的活性非常重要。

图 6 奥司他韦与N8催化区结合模式图

在系统分类中，甲型流感病毒NA可分为两大类，Ⅰ类（Group 1）包括N1、N4、N5、N8四种亚型，Ⅱ类（Group 2）包括N2、N3、N6、N7、N9五种亚型。2006年，随着Russell[43]等对N1、N4、N8的结构解析，人们发现：Ⅰ类NA催化区2号亚位点附近连接着开放的“150腔”；然而，Ⅱ类NA中“150-LOOP”处于封闭构象，使得Ⅱ类NA活性结合区旁边不存在该“150腔”，如图 7所示。“150腔”的发现为设计选择性的Ⅰ类NA抑制剂、解决病毒耐药问题提供了新思路。Pinto课题组[44]以奥司他韦为先导化合物，用带羟基侧链的三氮唑替换奥司他韦骨架5位上的氨基，得到了以化合物J为代表的Ⅰ类选择性的NAI（Ki = 1.5ⅹ10-9 ～ 4.6ⅹ10-10 M）。2013年，Kerry [45]通过化合物的共晶体结构，验证了化合物J同时占据NA催化区和“150腔”，是一种双位点抑制剂。2014年，在对奥司他韦母环5位氨基进行异硫脲取代时，Pinto课题组意外得到了螺环化

合物K（如图 8），其对HK1流感病毒的有效浓度为10-6～10-7 M。N8与化合物K的共结晶结构表明，化合物上螺环在催化区偏向150-LOOP，有利于“150腔”的形成，这为开发双位点抑制剂提供了一种思路[46]。

图 7[44] A.奥司他韦与N1结合模式；B.奥司他韦与N9结合模式

为了克服不利的药动学性质引发的耐药问题，Schade[47]也对奥司他韦母环5位氨基的取代进行了探讨。利用生物电子等排体和前药的设计原理，成功得到了药动学性质和口服生物利用度比较理想，同时对奥司他韦耐药的H1N1突变株有效的化合物L，其活化代谢物抗H1N1的IC50 = 14.5 nM。

除了对奥司他韦母环5位氨基的结构改造，Cheng[48]用磷酸基和磷酸酯将母环1位上羧基替换，成功得到了化合物M，其能够在纳摩水平甚至皮摩水平抑制多种流感病毒复制，包括H274Y耐药毒株。

开发抗流感病毒不可逆抑制剂也是解决当前耐药问题的一种思路。2013年，Kim[49]通过对神经氨酸酶催化过渡态的研究，设计合成了以化合物N为代表的一系列α，β-二氟取代的化合物。这些化合物能够与神经氨酸酶催化区Tyr406形成短暂的共价中间体，广谱强效抑制流感病毒，包括扎那米韦和奥司他韦耐药毒株。在动物实验中，药效与上市药物相当或者优于上市药物。

图 8 上市及最新报道的NAI

总的来说，对于NAI日益严重的耐药问题，人们将大量关注集中于奥司他韦母核5位上的氨基的改构，母核1位羧基改构及不可逆抑制剂设计也有零星的探讨；NA催化区2号亚位点旁边“150腔”的发现与结构解析，也为人们解决NAI的耐药问题提供了新思路。

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