一、材料、试剂和仪器
材料：动物组织，一次性塑料手套，200 μl、1000 μl吸头。
试剂：TRIzol总 RNA提取试剂，氯仿，异丙醇，0.1％DEPC，75％乙醇（用RNase-free水配制），RNase-free水。
仪器：烘箱，超低温冰箱，高速冷冻离心机，普通离心机，高压灭菌锅，微量取样器，研钵
二、提取操作步骤
1、匀浆处理：
a、动物组织：以鼠肝脏RNA提取为例。取新鲜或-70'C冻存组织，大约10-30 mg组织加1m1 TRIquick，用一次性组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。
b、单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIquick裂解细胞，每10cm2面积加1ml TRIquick。用取样器吹打混匀。
c、细胞悬液：离心收集细胞。每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1 ml TRIquick。
d、血液处理：直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，8，000-10，000 rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200 μl血液收集的白细胞沉淀加入1 ml TRIquick。
2、将匀浆样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。如不连续进行实验，加入TRIquick的匀浆样品可在－70'C下保存1-2个月。
3、可选步骤：4℃ 12，000 rpm离心5-10分钟，取上清。如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4、每使用1ml TRIquick向匀浆样品中加0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟，使其自然分相。如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2分钟代替。 5、4℃ 12，000 rpm离心10-15分钟。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（通常为550 μl）转移到新管中。 6、在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，混匀，室温放置10-20分钟。
7、4℃ 12，000 rpm离心10分钟。去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
8、加入1 ml 75％乙醇（用RNase-free的水配置）洗涤沉淀。每使用1 ml TRIquick，至少加1m1 75％乙醇。
9、4℃ 7，000 rpm离心5分钟，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注
意不要吸取到沉淀。转速不要超过7，000 rpm，否则盐离子会沉淀下来，导致RNA不易溶解。
10、室温放置晾干（不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干1-2分钟左右即可），加入适量RNase-free水（根据实验需要加入30-100 μl水），充分溶解RNA。
11、RNA样品－70℃下保存。 预防RHase污染，应注意以下几方面：
1、经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。 2、使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3、RNA在TRIquick试剂中时不会被RNase污染。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4、配制溶液应使用RNase-free的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1％(v／v)，放置过夜，高压灭菌）。
不同组织或细胞RNA提取预期得率 植物叶片 动物组织 动植物培养细胞 革兰氏阴性细菌 血液 RNA纯度及浓度检测：
完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1．2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15-30分钟)检测完整性，由于细胞中70-80％的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当子28S和18S rRNA；植物叶片中由干含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5－2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260／OD 280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260／OD 280读数(10 mM TRis，pH7.5)在1.8－2.1之间，比值为2．0是高质量RNA的标志。OD260／OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10 mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260／OD280读数1.8－2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5－1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260、OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：
100—200 μg/ g 叶片 200—400 μg/ g 肝脏组织 5—10 μg/ 106 细胞 2—10 μg/ ml DH5α过夜菌 3—5 μg/ ml 人全血 终浓度(ng／μl)＝(OD260)×(稀释倍数n)×40 常见问题分析：
1、得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底，样品匀浆时加的试剂量太少 B．RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65 ：A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高 C．匀浆样品时未在室温放置5分钟 D．吸取水相时混入了有机相 E．RNA沉淀未完全溶解。
2、RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃ C.细胞在用胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理 E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5 3、DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少
B. 样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液
实验二、 RNA含量和纯度的测定
一、材料、试剂和仪器 材料: 待检测的RNA样品 试剂: DEPC-H2O
仪器: 紫外分光光度计，石英比色杯 二、实验程序
1、开机设定参数，具体操作参照仪器说明 。 2、用DEPC-H2O做空白调零。
3、将RNA样品按一定的比例稀释于DEPC-H2O。 4、混匀样品后在260nm、280nm和310nm波长下读数。 三 结果与分析
定量测定DNA或RNA，应选230 nm、260 nm、280 nm和310 nm波长读数。其中260 nm读数用来估算样品中核酸浓度，310nm为背景吸收值。1个OD260值相当于40 μg/mL RNA。 样品浓度（μg/mL）=[OD260- OD310]×稀释倍数×40
OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度，OD260/OD230估计去盐的程度。对于RNA纯制品，其OD260/OD280≈2.0，OD260/OD230应大于2。OD260/OD280<2.0可能是蛋白污染所致，可以增加酚抽提。
实验三、 琼脂糖凝胶的制备
一、实验目的：
学习与掌握DNA电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量以及分子量，及分离不同大小DNA片段。 二、实验原理
电泳是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算： Ｕ =υ/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt
Ｕ为迁移率（cm2·V-1·min-1）；υ为颗粒泳动速度（cm·s-1）；E为电场强度（ V·cm-1）；d 为颗粒泳动的距离（cm）；l为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为通电时间（s或min）。通过测量d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率。
颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。影响琼脂糖电泳迁移的主要因素包括电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗现象、温度的影响、支持物的影响等。 三、材料、试剂和仪器
待测样品液，琼脂糖，电泳缓冲液，电泳仪，电泳槽，微波炉，电子天平，移液器、枪头；
电泳载样缓冲液：0.25％ 溴酚蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃ 溴化乙锭(EB)溶液：将EB配制成10 mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器。
四、操作步骤
1、 取1×TAE电泳缓冲液，
2、 胶液的制备：称取0.5g琼脂糖，置于200 ml锥形瓶中，加入50ml 1×TAE电泳缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为1％琼脂糖凝胶液。加热过程
中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。
3、 胶板的制备：将有机玻璃电泳两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。将琼脂糖溶液琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
4、 加样：取4 μl待测液与1μl载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5、 电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40 mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
6、 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室温下染色20-25分钟。
7、 观察和拍照：在波长为254 nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。
实验四、电泳检测RNA完整性
一、实验目的：
学习与掌握利用电泳技术检测RNA完整性的方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性。 二、实验原理
RNA完整性则可以通过琼脂糖变性电泳分析检测。常见的变性电泳有甲醛变性电泳、戊二醛变性电泳等。完整的RNA的甲醛电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。若两条带不明显， 则说明RNA部分降解，可能的原因是污染了RNase，
或操作剧烈。RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%－1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。
三、材料、试剂和仪器
待测RNA样品液，待测样品液，琼脂糖，电泳缓冲液，电泳仪，电泳槽，微波炉，电子天平，移液器、枪头；
电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃； 溴化乙锭(EB)溶液：将EB配制成10 mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器。 四、操作步骤
1、用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。 2、用移液器吸取总RNA样品4μl与1μl载样液混合，混匀后，小心加入点样孔。 3、打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min，用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
实验四、PCR引物设计
一、实验目的
学习和掌握PCR引物设计的原则与要求，并利用引物设计软件设计特异引物。 寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值等重要的物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RT-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的
影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。 计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。一些影响PCR反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，易于在计算机软件中被编码和限定。计算机的高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量计算。通过对成千种组合的检测，调整各项参数，可提出适合用户特殊实验的引物。因此通过计算机软件选择的引物的总体“质量”（由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出的引物。
需要指出的是，引物不必与模板完全同源，因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5’端的各种修饰，这种对引物的修饰不会妨碍PCR反应，而会在以后使用扩增子时发挥作用。
二、基本PCR引物设计原理与参数要求
引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。
①引物长度：特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。
总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。
②引物的二级结构：包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。
③引物GC含量和Tm值：PCR引物应该保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56～62℃范围内，这可为有效退火提供足够热度。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了Tm值导致特异性的丧失。这种情况下引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大。若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和Tm值的协调非常关键。一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度，同时引物和产物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好。
④引物的额外序列与退火温度：若有额外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长的引物。一般说来，引物5’端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5’端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。
在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制酶的有效切割要求在它们的识别序列的5’端有2至3个非特异的额外碱基，这样就会增加引物的非模板特异序列的长度。长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算，而这对于确定PCR反应时的退火温度又是必须的。对于低于20个碱基的引物，Tm值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。
⑤引物的3’末端核苷酸组成 ：引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3’末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。
引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在3’末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。
引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG。此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。
需要注意的是，引物3’末端应尽量避免T。实验证明，以T结尾的引物即使与T, G或
C错配仍可有效延伸。
⑥PCR产物的长度及在靶序列内的位置：所有的计算机程序都提供对PCR产物长度范围的选择。一般说来，PCR产物长度对扩增效率有影响。特定的应用情况下，PCR产物长度部分取决于模板材料。
预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。若目的是建立测定特异DNA片段的临床检验方法，120～300bp的小DNA扩增产物可能是最好的。产物应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息。这一长度范围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到，从而减少扩增时间。
其他PCR方法有不同的最佳产物长度。例如，通过定量的RNA-PCR检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。这些产物一般在250～750bp范围内。
此外，若在cDNA序列内找寻PCR引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在mRNA的编码区域内，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像3’末端非编码区域与许多其他mRNA有同源性；第二，尽力把引物放在不同的外显子上，以便使RNA特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。
若PCR的目的是克隆一个基因或cDNA的特异序列，产物的大小是根据具体应用预选的。在这里，计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对的信息。
选择用来扩增来自不同物种DNA的引物时，应避开mRNA的5’和3’末端非翻译区序列，因为它们可能没有任何的同源性。 三、利用Primer Premier 5.0设计引物 （一）Primer Premier 5.0功能
“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计(限制性内切酶位点分析(同源性分析功能（
)和DNA基元(motif)查找(
)、
)。“Premier”还具有
）。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并
）、语音提示键盘输入
引物，另外还有序列“朗读”、DNA与蛋白序列的互换（（
）等。
（二）在NCBI上搜索目的基因，找到该基因的mRNA或DNA序列， Copy该序列作为软件查询序列的候选对象。
（二）Primer Premier 5.0使用步骤
1、“Premier”软件启动界面如下：
其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10序列，-35序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，点击
按钮，界面如下：
进一步点击
按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索
目的（Seach For）有三种选项，PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按时，再按
，随之出现的Search Progress窗口中显示Search Completed
，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），
下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口，如图所示
该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由
变成
，点击该按钮，在左下角的窗
口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有
，只有
。值得注意的是中间一栏的末尾给出
该引物的最佳退火温度，可参考应用。
在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击引物序列。若要回到搜索结果中，则点击
按钮。
，然后修改
如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。
实验五、PCR扩增技术
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段。由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的
模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途： (1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针； (2) 由少量mRNA生成 cDNA文库； (3) 从cDNA中克隆某些基因； (4) 生成大量DNA以进行序列测定； (5) 突变的分析； (6) 染色体步移；
(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。 一、试剂准备
1、DNA模版
2、对应目的基因的特异引物 3、10×PCR Buffer
4、2mM dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5、Taq酶 二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5 μl
dNTP mix （2mM） 4 μl 引物1（10pM） 2 μl 引物2（10pM） 2 μl Taq酶 （2U/μl） 1 μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2、调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。
3、结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4、PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。 三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化
PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。
1、反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3，室温），1.5mM MgCl2。Mg的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg
2+
2+
2+
为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。
2、dNTP：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg结合，使游离的Mg浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg浓度。
3、Taq DNA聚合酶酶：在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。
4． 引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR
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反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：
⑴引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。
⑵引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常利用计算机辅助设计。
⑶人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。
⑷引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/μl较好。
⑸ 引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。
5、模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或10拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。
6． PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。 四、注意事项
1、PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。
２、纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３、所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
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６、试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
实验六、DNA酶切及凝胶电泳
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类，Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的
环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。
在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 一、材料、设备及试剂 材料
λDNA：购买或自行提取纯化；重组pBS质粒或pUC19质粒； EcoRI酶及其酶切缓冲液：购买成品； HindⅢ酶及其酶切缓冲液：购买成品；
琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 设备
水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉，紫外透射仪 试剂
5×TBE电泳缓冲液
6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
二、操作步骤 （一）DNA酶切反应
1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号，用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl，再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温2-3小时，使酶切反应完全。
3、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。 （二）DNA分子量标准的制备
采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子，其商品溶液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段，长度分别为23.1，9.4，6.6，4.4, 2.3， 2.0， 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段，长度 分别为21.2， 7.4， 5.8， 5.6， 4.9和2.5kb。 （三）琼脂糖凝胶的制备
1、琼脂糖凝胶的制备，见实验三。
2、加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
3、电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
4、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室温下染色20-25分钟。
5、观察和拍照：在波长为254 nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。
6、DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上，以样品槽为起点，用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离，以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标，以迁移距离为横坐标，在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线，即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。
7、DNA酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上，用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离，根据此数值，在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值，进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线，则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之，若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。 8、DNA酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切，双酶切和多酶切的电泳分析结果，对
照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理，然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示，即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。
[注意] 1、酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。
2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg DNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不易降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。
4、观察DNA离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm），以减少紫外光切割DNA。
5、EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
6、 当EB太多，胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30分钟后再观察。
常用试电泳缓冲液
50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液
成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 2mol/L Tris碱 1mol/L 乙酸 100 mmol/L EDTA 水 242g
57.1 ml的冰乙酸（17.4 mol/L） 200ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 补足1L
5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液
成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 445 mmol/L Tris碱 445 mmol/L 硼酸盐 10 mmol/L EDTA 水 54g 27.5g 硼酸
20 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 补足1L 染料
1％溴酚蓝（bromophenol blue）
加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。 1％二甲苯青FF（xylene cyanole FF）
溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。 10mg/ml的溴化乙锭（ethidium bromide）
小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100ml水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。 凝胶上样液（gel loading solutions）
6×碱性凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.3 N 氢氧化钠 6 mmol/L EDTA 18％聚蔗糖（400型） 0.15％溴甲酚绿 0.25％二甲苯青FF 水 300ul 10N 氢氧化钠 120ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 1.8g 15mg 25mg 补足到10ml
6×聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 15％聚蔗糖（400型） 水 1.5ml 1％溴酚蓝 1.5ml 1％二甲苯青FF
100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 1.5g
补足到10ml
6×溴酚蓝/二甲苯青/聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.25％溴酚蓝 0.25％二甲苯青FF
15％聚蔗糖（400型） 水 2.5ml 1％溴酚蓝 2.5ml 1％二甲苯青FF 1.5g 补足到10ml
6×甘油凝胶上样液（4℃贮存）
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 50％甘油
水 1.5ml 1％溴酚蓝 1.5ml 1％二甲苯青FF
100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 3ml 3.9ml
6×蔗糖凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 40％聚蔗糖 水 1.5ml 1％溴酚蓝 1.5ml 1％二甲苯青FF
100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 4g
补足到10ml
10×十二烷基硫酸钠/甘油凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.2％溴酚蓝 0.2％二甲苯青FF 200 mmol/L EDTA 0.1％SDS 50％甘油 水 20mg 20mg
4ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 100ul 10％ SDS 5ml 补足到10ml 剂的配制
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