血小板裂解液(HPL)替代胎牛血清(FBS)培养用于人体的骨髓间质干细胞

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109666635 A(43)申请公布日 2019.04.23

(21)申请号 201710991038.3(22)申请日 2017.10.16

(71)申请人 广东食品药品职业学院

地址 510000 广东省广州市天河区龙洞北

路321号(72)发明人 李辉　(51)Int.Cl.

C12N 5/0775(2010.01)

权利要求书1页 说明书3页

(54)发明名称

血小板裂解液(HPL)替代胎牛血清(FBS)培养用于人体的骨髓间质干细胞的方法(57)摘要

本发明涉及用HPL替代FBS培养MSCs能够避免动物源性物质对MSCs的临床应用产生的负面影响，对MSCs的体外培养扩增及临床应用起到相应的指导作用。本发明HPL能够促进MSCs的成骨/成脂分化能力，由此看来，HPL培养的MSCs可能在骨组织工程领域得到更好的应用；在成骨不全等骨组织缺陷或损伤疾病的治疗和修复中可能取得更好的疗效，为这些疾病的细胞治疗提供更高效的细胞制剂。

CN 109666635 ACN 109666635 A

权　利　要　求　书

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1.一种血小板裂解液(HPL)替代胎牛血清(FBS)培养用于人体的骨髓间质干细胞的方法，其特征在于，收集10袋机采血小板(每个供者0.2个单位)在-80℃冻存，接着快速在37℃溶解。900r/min离心30min。取上清，0.22μm过滤器过滤，加肝素2U/ml以防止血小板凝胶的形成。血小板裂解液采用ELISA方法进行PDGF-AB(人血小板衍生生长因子AB)，bFGF(成纤维细胞生长因子)，IGF-1(胰岛素样生长因子1)，TGF-β1(转化生长因子β1)4种细胞因子浓度的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，7.5％HPL和10％FCS培养MSCs原代过程中，均在接种5d左右出现贴壁细胞，呈长梭形，克隆样增殖，10～15d达到融合，消化传代。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，MSCs培养至第5代，进行消化，检测表面标记CD45，CD34，CD29，CD44，CD105，CD106。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，10％的FCS培养的MSCs其细胞周期为S期：(1.42±1.83)％，G0-G1期：(96.97±0.95)％，G2-M期：(1.61±1.56)％；7.5％的HPL培养的MSCs其细胞周期为S期(3.54±2.55)％，G0-G1期：(94.58±1.56)％，G2-M期：(1.88±1.64)％；从上述数据可以看出G0～G1期细胞所占比例在90％以上，这说明绝大部分细胞处于静止态，保留自我更新和增殖能力，这符合干细胞的特性。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对培养至第5代的HPL和FCS培养条件下MSCs分别进行成骨诱导，诱导10-12天左右光镜下可见致密团块样的结节形成，结节大小不等，对其进行茜素红染色，结节被染为红色，证实为钙结节。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，同样对培养至第5代HPL和FCS培养条件下的两组MSCs进行成脂诱导，在诱导8天时大多数细胞内脂滴已经明显可见，随着诱导时间的延长，小脂滴逐渐聚集成大的脂泡，诱导12天后运用油红0染色可见细胞内脂滴被染成红色。

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血小板裂解液(HPL)替代胎牛血清(FBS)培养用于人体的骨髓

间质干细胞的方法

技术领域

[0001]本发明涉及间质干细胞及转化。

背景技术

[0002]间质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的一类具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，可以从多个物种的多种组织中分离出MSCs，如骨髓、脂肪组织、外周血等。MSCs具有多向分化潜能，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞等[1]。目前，MSCs被广泛应用于组织工程领域以及某些疾病的临床试验性治疗当中，Horwitz EM[2]等对患有成骨不全的6名儿童在接受常规的骨髓移植后进行同种异基因MSCs输注，经MSCs输注后5名患儿的生长速度显著加快，根据对这5例成骨不全患儿MSCs输注的疗效观察，作者认为MSCs可以用于成骨不全患儿骨髓移植后的细胞治疗，并进一步提出MSCs可能对其他遗传性或获得性疾病具有一定的疗效。此外，Quarto R等及Simon Tilley等运用组织工程方法利用MSCs治疗骨组织缺损，取得确切疗效[3，4]。[0003]临床应用时通常需要大量的MSCs，目前认为适宜的临床输注剂量为成人每公斤体重输注2×106个MSCs[19]，因此MSCs被用于临床治疗时必须经过体外培养扩增才能达到足够的细胞量。MSCs易于体外分离和扩增，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)被广泛的用于MSCs的培养当中，有可能导致朊病毒或者某些未确诊的动物传染病的传播，此外，在培养过程中动物源的蛋白或肽可能会被整合至MSCs中从而导致免疫排斥。Spees JL[5]等发现大鼠在反复输注用FBS培养的MSCs后产生了明显的体液免疫反应；Horwitz EM[2]等在利用MSCs治疗儿童成骨不全的试验中同样产生了免疫反应，有一名患儿在两次输注MSCs后出现荨麻疹，并且MSCs的输注对这名患儿无明显疗效。因此，一些研究尝试用其他物质代替FBS来培养MSCs，Bieback K[6]等用人血清、血浆代替FBS培养MSCs，但没有获得很好的效果，血清或血浆培养MSCs时会混杂大量的造血细胞，而且MSCs在培养至第四代时增殖速度明显降低，很难达到临床应用所需要的细胞量；然而用人血小板裂解液(human platelet lysate，HPL)培养时却不存在上述缺点。HPL是裂解血小板后得到的富含生长因子的血浆，其中含有由血小板分泌的主要的生长因子，如血小板源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF-I)等，HPL的培养能够比FBS更高效的促进MSCs体外扩增，同时保持其多向分化潜能以及免疫调节功能，HPL可以作为FBS合适而安全的替代品。

发明内容

[0004]本发明所要解决的技术问题在于，提供一种血小板裂解液(HPL)替代胎牛血清(FBS)培养用于人体的骨髓间质干细胞的方法。[0005]本发明解决其技术问题，采用的技术方案是，提供一种血小板裂解液(HPL)替代胎牛血清(FBS)培养用于人体的骨髓间质干细胞的方法，其特征在于，收集10袋机采血小板

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(每个供者0.2个单位)在-80℃冻存，接着快速在37℃溶解。900r/min离心30min。取上清，0.22μm过滤器过滤，加肝素2U/ml以防止血小板凝胶的形成。血小板裂解液采用ELISA方法进行PDGF-AB(人血小板衍生生长因子AB)，bFGF(成纤维细胞生长因子)，IGF-1(胰岛素样生长因子1)，TGF-β1(转化生长因子β1)4种细胞因子浓度的检测[0006]优选的，7.5％HPL和10％FCS培养MSCs原代过程中，均在接种5d左右出现贴壁细胞，呈长梭形，克隆样增殖，10～15d达到融合，消化传代。[0007]优选的，MSCs培养至第5代，进行消化，检测表面标记CD45，CD34，CD29，CD44，CD105，CD106。[0008]优选的，10％的FCS培养的MSCs其细胞周期为S期：(1.42±1.83)％，G0-G1期：(96.97±0.95)％，G2-M期：(1.61±1.56)％；7.5％的HPL培养的MSCs其细胞周期为S期(3.54±2.55)％，G0-G1期：(94.58±1.56)％，G2-M期：(1.88±1.64)％；从上述数据可以看出G0～G1期细胞所占比例在90％以上，这说明绝大部分细胞处于静止态，保留自我更新和增殖能力，这符合干细胞的特性[0009]优选的，对培养至第5代的HPL和FCS培养条件下MSCs分别进行成骨诱导，诱导10-12天左右光镜下可见致密团块样的结节形成，结节大小不等，对其进行茜素红染色，结节被染为红色，证实为钙结节[0010]优选的，同样对培养至第5代HPL和FCS培养条件下的两组MSCs进行成脂诱导，在诱导8天时大多数细胞内脂滴已经明显可见，随着诱导时间的延长，小脂滴逐渐聚集成大的脂泡，诱导12天后运用油红O染色可见细胞内脂滴被染成红色。[0011]本发明的有益效果是：本发明HPL能够促进MSCs的成骨/成脂分化能力，由此看来，HPL培养的MSCs可能在骨组织工程领域得到更好的应用；在成骨不全等骨组织缺陷或损伤疾病的治疗和修复中可能取得更好的疗效，为这些疾病的细胞治疗提供更高效的细胞制剂。

具体实施方式[0012]用HPL替代FBS培养MSCs能够避免动物源性物质对MSCs的临床应用产生的负面影响，对MSCs的体外培养扩增及临床应用起到相应的指导作用。本专利HPL能够促进MSCs的成骨/成脂分化能力，由此看来，HPL培养的MSCs可能在骨组织工程领域得到更好的应用；在成骨不全等骨组织缺陷或损伤疾病的治疗和修复中可能取得更好的疗效，为这些疾病的细胞治疗提供更高效的细胞制剂。

[0013]收集10袋机采血小板(每个供者0.2个单位)在-80℃冻存，接着快速在37℃溶解。900r/min离心30min。取上清，0.22μm过滤器过滤，加肝素2U/ml以防止血小板凝胶的形成。血小板裂解液采用ELISA方法进行PDGF-AB(人血小板衍生生长因子AB)，bFGF(成纤维细胞生长因子)，IGF-1(胰岛素样生长因子1)，TGF-β1(转化生长因子β1)4种细胞因子浓度的检测。

[0014]1.MSCs在HPL和FCS中增殖生长情况

[0015]7.5％HPL和10％FCS培养MSCs原代过程中，均在接种5d左右出现贴壁细胞，呈长梭形，克隆样增殖，10～15d达到融合，消化传代。HPL培养的MSCs相对[0016]FCS来说更趋向于成簇生长，且HPL培养的MSCs胰酶消化的时间为2～3min，而FCS

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培养的MSCs胰酶消化的时间为3～5min。10％FCS培养细胞呈长梭形，每代3d达到融合，7.5％HPL培养细胞形状与10％FCS培养细胞相似，也为长梭形，每代4d达到融合。取6株细胞P5OD值进行独立两组之间的t-检验，P＞0.05，因此7.5％HPL培养细胞增殖能力与10％FCS培养细胞增殖能力之间没有显著性差异。

[0017]2.HPL和FCS培养条件下表面标记的鉴定[0018]MSCs培养至第5代，进行消化，检测表面标记CD45，CD34，CD29，CD44，CD105，CD106。结果显示与FCS培养的MSCs相比，HPL培养并没有影响其表面标记的表达(P＞0.05)。[0019]3.HPL和FCS培养条件下细胞周期的鉴定[0020]10％的FCS培养的MSCs其细胞周期为S期：(1.42±1.83)％，G0-G1期：(96.97±0.95)％，G2-M期：(1.61±1.56)％；7.5％的HPL培养的MSCs其细胞周期为S期(3.54±2.55)％，G0-G1期：(94.58±1.56)％，G2-M期：(1.88±1.64)％；从上述数据可以看出G0～G1期细胞所占比例在90％以上，这说明绝大部分细胞处于静止态，保留自我更新和增殖能力，这符合干细胞的特性。两种体系培养条件下的MSCs细胞周期通过t检验，P＞0.05，表明两种培养体系在MSCs细胞周期方面并没有显著性差异。[0021]4.成骨诱导分化及定量鉴定结果

[0022]对培养至第5代的HPL和FCS培养条件下MSCs分别进行成骨诱导，诱导10-12天左右光镜下可见致密团块样的结节形成，结节大小不等，对其进行茜素红染色，结节被染为红色，证实为钙结节。对三个不同样本的两组MSCs的成骨分化结果进行定量鉴定及统计分析，含10％FBS的L-DMEM培养的MSCs成骨定量结果为4.151±5.631，而含7.5％HPL的L-DMEM培养的MSCs成骨定量结果为16.548±4.397，比较两组MSCs的成骨定量结果发现HPL能显著促进MSCs的成骨分化能力，P＜0.05。

[0023]5.成脂诱导分化及定量鉴定结果

[0024]同样对培养至第5代HPL和FCS培养条件下的两组MSCs进行成脂诱导，在诱导8天时大多数细胞内脂滴已经明显可见，随着诱导时间的延长，小脂滴逐渐聚集成大的脂泡，诱导12天后运用油红O染色可见细胞内脂滴被染成红色。对三个不同样本的两组MSCs的成脂结果进行定量鉴定及统计分析，含10％FBS的L-DMEM培养的MSCs成脂定量结果为0.497±0.105，而含7.5％HPL的L-DMEM培养的MSCs成脂定量结果为0.239±0.030，比较两组MSCs的成脂定量结果发现HPL抑制了MSCs向脂肪细胞分化(P＜0.05)。[0025]可以理解的，以上实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以对上述技术特点进行自由组合，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的等同变换与修饰，均应属于本发明权利要求的涵盖范围。

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