(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN201110122398.2 (22)申请日 2011.05.12 (71)申请人 江南大学
地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院 (72)发明人 徐岩 吴群 陈良强
(74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 代理人 时旭丹 (51)Int.CI
C12N1/18 C12N1/16 C12Q1/04 C12G3/02 C12R1/84 C12R1/645 C12R1/865
(10)申请公布号 CN 102226155 A (43)申请公布日 2011.10.26
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
中国酱香型白酒生产中高产乙醇低
产杂醇油的酵母的筛选与应用 (57)摘要
中国酱香型白酒生产中高产乙醇低
产杂醇油的酵母的筛选与应用，属于生物
工程技术领域。所述菌株为异常毕赤酵母CGMCC4740、粟酒裂殖酵母CGMCC4744、拜尔接合酵母
CGMCC4745、丝孢酵母CGMCC4746、酿酒酵母CGMCC4747、少孢酵母
CGMCC4748、发酵毕赤酵母CGMCC4750中任一一株。菌株是从中国多家名酒厂的各种大曲、酒醅、酿造原料、酿造环境中分离得到，其筛选方法是取曲样、酒醅、酿造原料或酿造环境物质，经过稀释涂布TTC初筛平板，挑选红色显著的菌落，再转接于摇瓶培养进行复筛，发酵液分别采用蒸馏比重法和HS-SPME-GC-MS测定乙醇及杂醇油含量，筛选获得乙醇浓度高以及杂醇油浓度低的菌株。该菌株可应用于食品工业、酿造酒工业中。 法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.高产乙醇低产杂醇油的酵母，其分类命名为
异常毕赤酵母（Pichia anomala）BJY-1，保藏编号CGMCC No. 4740，
粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）BJY-5，保藏编号CGMCC No. 4744，
拜尔接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）BJY-6，保藏编号CGMCC No. 4745，
丝孢酵母（Trichosporon asahii）BJY-7，保藏编号CGMCC No. 4746，
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BJY-8，保藏编号CGMCC No. 4747，
少孢酵母（Kazachstania exigua）BJY-9，保藏编号CGMCC No. 4748，
发酵毕赤酵母（pichia fermentans）BJY-11，保藏编号CGMCC No. 4750，
以上菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种权利要求1所述的高产乙醇低产杂醇油的酵母的筛选方法，其特征在于在中国酱香型白酒生产中将大曲、酒醅、酿造原料或酿造环境物质与无菌水混合后，经过稀释涂布TTC初筛平板，挑选红色显著的菌落，再转接于液体发酵培养基，摇瓶培养进行复筛，发酵液分别采用蒸馏比重法和HS-SPME-GC-MS测定乙醇及杂醇油含量，筛选获得产乙醇浓度高以及产杂醇油浓度低的菌株；
摇瓶发酵培养条件为：接种量为0.1×106～5×106个/mL，培养基为：采用YPD、高粱汁或麦芽汁液体培养基，高粱汁或麦芽汁制作方式为：20～200g高粱或麦芽样品经粉碎后，加mL/g计1～4倍的水，蒸煮1-5h，呈糊状，冷却后加入10～50 U/g的糖化酶，于40～80℃保持2～10h，过滤、离心所得滤液，糖度为10~15oBx；调节pH为2～5，25～35℃，150rpm，摇瓶培养24～120h。
3.权利要求1所述的高产乙醇低产杂醇油的酵母的应用，其特征在于在各种酿造酒、蒸馏酒、配制酒的酿造工业和食品工业中的应用。
说 明 书
技术领域
本发明涉及高产乙醇低产杂醇油的酵母的筛选方法，及应用该方法在中国酱香型白酒生产中筛选高产乙醇低产杂醇油的酵母及其在食品工艺、酿造酒工业中的应用。属于生物工程技术领域。 背景技术
乙醇是酿造酒中最重要也是最主要的成分之一，中国白酒中乙醇含量高达40%～55%（v/v）；黄酒中为14%～20%；啤酒中为2%～5%。酵母是产生乙醇的主要微生物，也是酿造酒工业中不可缺少的微生物。因此，寻找高产乙醇的酵母能够优化酿造工艺，降低生产成本，在酿酒行业中具有重要的意义。
杂醇油是酵母在酿酒发酵中产生的次生代谢产物，包括正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、仲戊醇、己醇和庚醇等。它是白酒中醇甜和助香剂的主要物质，对形成酒的风味和促使酒体丰满、浓厚起着重要的作用。适宜的杂醇油含量及各种杂醇油之间的比例协调可使酒的口感柔和协调、酒体丰满圆润和味道独特，但白酒中如杂醇油含量过高，不仅会导致产品辣、苦、涩，影响酒的口感，而且对人体有毒害作用。杂醇油在人体内氧化速度较乙醇慢，停留时间长，会引起头痛，神经系统充血等症状。杂醇油同时也是造成白酒出现白色浑浊的原因之一，因此其含量必须控制在一定范同内，国标规定白酒中杂醇油的含量为≤0.20g/100 mL(以白酒中含量最大的异丁醇、异戊醇计)。
目前，在传统的酿造酒中，杂醇油含量普遍偏高的问题已经广泛引起了业界的关注。因此，为降低其杂醇油含量，使其控制在合适的范围内，生产上已采取了种种措施，如采用低温发酵、优化用曲量等。但由于其工艺复杂，影响因素繁多，生产中还未得到很好的解决。最根本的措施是采用低产杂醇油的酵母菌种进行发酵，但是，杂
醇油是酵母在乙醇发酵过程中的必然副产物，高产乙醇能力的菌株产杂醇油能力一般也较强，因此高产乙醇与低产杂醇油往往难于两全。目前，也有通过诱变选育低产杂醇油的酒精酵母菌株的报道，但在酿造工业中存在回复突变等问题，生产上存在风险。因此只有选育低产杂醇油且高产乙醇的野生酵母才是最根本的解决手段。
本发明所筛选获得的酵母是从中国多家名酱香型白酒厂的各种大曲或酿造酒醅中筛选所得，具有高产乙醇低产杂醇油的功能。该菌株为首次从中国白酒酿造过程中获得的高产乙醇且低产杂醇油的酵母。该菌株是优良的酿酒功能菌株。该菌株能够有效应用于传统酿造酒工业，优化酿造酒生产工艺，降低酿造酒生产成本，提高酒类品质。 发明内容
（1）要解决的技术问题
本发明要解决的一个技术问题是提供高产乙醇低产杂醇油的酵母菌株，本发明所要解决的另一个技术问题是提供了高产乙醇低产杂醇油的酵母菌株的筛选方法，以及将所得的酵母应用于酿造酒工业中。
（2）本发明的技术方案
高产乙醇低产杂醇油的酵母，其分类命名为
异常毕赤酵母（Pichia anomala）BJY-1，保藏编号CGMCC No. 4740，
粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）BJY-5，保藏编号CGMCC No. 4744，
拜尔接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）BJY-6，保藏编号
CGMCC No. 4745，
丝孢酵母（Trichosporon asahii）BJY-7，保藏编号CGMCC No. 4746，
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BJY-8，保藏编号CGMCC No. 4747，
少孢酵母（Kazachstania exigua）BJY-9，保藏编号CGMCC No. 4748，
发酵毕赤酵母（pichia fermentans）BJY-11，保藏编号CGMCC No. 4750，
上述菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
高产乙醇低产杂醇油的酵母菌株的筛选：
所述的高产乙醇低产杂醇油的酵母的筛选方法，在中国酱香型白酒生产中将大曲、酒醅、酿造原料或酿造环境物质与无菌水混合后，经过稀释涂布TTC初筛平板，挑选红色显著的菌落，再转接于液体发酵培养基，摇瓶培养进行复筛，发酵液分别采用蒸馏比重法和HS-SPME-GC-MS测定乙醇及杂醇油含量，筛选获得产乙醇浓度高以及产杂醇油浓度低的菌株。
取0.5～5g大曲、酒醅、酿造原料或酿造环境物质溶于15～150mL无菌生理盐水摇床振荡30～150min，再稀释，涂布TTC初筛平板。
TTC初筛培养：TTC上层培养基（g/L）：葡萄糖5，琼脂15，121℃灭菌20min，冷却至60℃左右时，加入TTC溶液（三苯基四氮唑盐酸盐，终浓度0.5）后，立即倾倒底层平板。TTC下层培养基：YPD琼脂。涂布TTC初筛平板后30℃培养24h，长出可见菌落后，倒入约12mL TTC上层培养基覆盖原来菌落，之后在30℃下避光保温2～3h，由菌落的呈色来判断酵母产酒精能力。
TTC初筛挑选红色显著的菌落，再转接于摇瓶培养进行复筛，摇瓶发酵培养条件为：接种量为0.1×106～5×106个/mL，培养基为：采用YPD、高粱汁或麦芽汁液体培养基，高粱汁或麦芽汁制作方式为：20～200g高粱或麦芽样品经粉碎后，加mL/g计1～4倍的水，蒸煮1-5h，呈糊状，冷却后加入10～50U/g的糖化酶，于40～80℃保持2～10h，过滤、离心所得滤液，糖度为10~15oBx；调节pH为2～5，25～35℃，150rpm，摇瓶培养24～120h。
所述的高产乙醇低产杂醇油的酵母的应用，在各种酿造酒、蒸馏酒、配制酒的酿酒工业和食品工业中的应用。高产乙醇低产杂醇油的酵母在酿造酒工业中的应用：将该菌株制成液体或固体菌制剂，添加于酿造酒酿造过程中，能够有效增加酿造中该菌株的生物量，并有效提高乙醇的含量，减少杂醇油的生成，最终提高酿造酒的品质。
乙醇浓度测定：蒸馏比重法测定乙醇浓度。同时用减重法测定CO2释放质量。
杂醇油浓度测定：采用HS-SPME-GC-MS方法，15 mL顶空瓶中加入5～10 mL澄清发酵液，1～5 g NaCl，以4-甲基-2-戊醇为内标，进行顶空固相微萃取。顶空固相微萃取的条件为：三相(Car/DVB/PDMS)萃取头，60 ℃预热5～10 min，萃取吸附30～50 min，GC解吸5～10 min。
（3）有益效果
本发明所筛选获得的酵母是从中国酱香型白酒酿造过程中筛选所得，具有高产乙醇低产杂醇油的功能。该批菌株为首次从中国白酒酿造过程中获得的高产乙醇且低产杂醇油的酿酒酵母。该批菌株每株都是优良的酿酒功能菌株。这些菌株能够有效应用于酿造酒行业，优化酿造酒生产工艺，降低酿造酒生产成本，提高酒质。
生物材料样品保藏：中国酱香型白酒生产中高产乙醇低产杂醇油的酵母，其分类命名为：异常毕赤酵母（Pichia anomala ）BJY-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No. 4740，保藏日期2011年4月6日；
粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）BJY-5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4744，保藏日期2011年4月6日；
拜尔接合酵母（Zygosaccharomyces bailii ）BJY-6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4745，保藏日期2011年4月6日；
丝孢酵母（Trichosporon asahii ）BJY-7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4746，保藏日期2011年4月6日；
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BJY-8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4747，保藏日期2011年4月6日；
少孢酵母（Kazachstania exigua ）BJY-9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4748，保藏日期2011年4月6日；
发酵毕赤酵母（pichia fermentans）BJY-11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4750，保藏日期2011年4月6
日。 附图说明
图1. 异常毕赤酵母（Pichia anomala）CGMCC No. 4740细胞形态电镜照片。
图2. 少孢酵母（Kazachstania exigua）CGMCC No. 4748细胞形态电镜照片。
图3. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No. 4747高粱汁发酵培养释放CO2时间曲线。
图4.发酵毕赤酵母（pichia fermentans）CGMCC No. 4750高粱汁发酵培养释放CO2时间曲线。
具体实施方式
实施例1：高产乙醇低产杂醇油的酵母菌株的筛选
取0.5g酒醅溶于15mL无菌生理盐水摇床振荡30分钟，再稀释，涂布TTC初筛平板，挑选红色显著的菌落，再转接于摇瓶培养进行复筛，发酵液分别采用蒸馏比重法和HS-SPME-GC-MS测定乙醇及杂醇油含量，筛选获得乙醇浓度高以及杂醇油浓度低的菌株。
TTC初筛培养：TTC上层培养基（g/L）：葡萄糖5，琼脂15，121℃灭菌20min，冷却至60℃左右时，加入TTC溶液（三苯基四氮唑盐酸盐，终浓度0.5）后，立即倾倒底层平板。TTC下层：YPD琼脂。30℃培养24h，长出可见菌落后，倒入约12mL TTC上层培养基覆盖原来菌落，之后在30℃下避光保温2～3h，由菌落的呈色来判断酵母产酒精能力。
摇瓶培养条件为：接种量为0.1×106～5×106个/mL，培养基条件为：采用麦芽汁培养基，制作方式为：20g麦芽样品经粉碎后，加1～4倍体积的水，蒸煮1-5h，呈糊状，冷却后加入10～50单位/g的糖化酶，于40～80℃保持2～10h，过滤、离心所得滤液，糖度为10oBx；调节pH为4～5，25～35℃，150rpm，摇瓶培养24～120h。
实施例2：高产乙醇低产杂醇油的酵母及其分子生物学鉴定
对获得的不同高产乙醇低产杂醇油的酵母进行分子生物学鉴定，利用酵母特异分类鉴定引物分别扩增菌株的26srDNA片段，经凝胶电泳检测。随后进行测序比对，确定所筛得酵母的种属。将菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，酵母种属及保藏编号见表1。
表1高产乙醇低产杂醇油的酵母
实施例3：菌株发酵产乙醇及杂醇油测定
以某酒厂所用的2株产酒酵母为对照，将本专利所提供的不同高产乙醇低产杂醇油的酵母，采用pH为5，糖度为10oBx的高粱汁培养基，
1×106个/mL的接种量，30℃，150rpm，摇瓶培养72～96h，产乙醇及杂醇油浓度见表2。
表2 酵母高粱汁培养基发酵产乙醇结果
注：乙醇对糖的理论转化率为51.1％。
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