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毕业设计(论文)外文

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院系名称：粮油食品学院 专业班级： 食工F0707 学生姓名： 郭玉龙 学 号： 20074060808 指导教师： 侯利霞 教师职称： 副教授 起止日期：2011-02-28至2011-03-25地 点: 实验楼220-2

题 目: 含有咖啡酸的组氨酸二肽的抗氧化活性

附 件： 1.外文资料翻译译文；2.外文原文。

指导教师评语： 签名： 年 月 日

含有咖啡酸的组氨酸二肽的抗氧化活性 Hyo-Suk Seo, Seon-Yeong Kwak, Yoon-Sik Lee

（首尔大学化学与生物工程学院，韩国 首尔 151-744）

文章历史：收稿于2009年12月28日；修订于2010年4月19日；接受于2010年4月28日；网上提供于2010年5月6日

关键词：抗氧化剂；咖啡酸（CA）；咖啡酰组氨酸（CA-His）；抗氧化活性 摘要：抗氧化剂已经被运用在食品和化妆品行业中，用来中和活性氧（ROS）和自由基的活性。含组氨酸的二肽是自然界存在的强效抗氧化剂。此外，羟基酸（HCA）的肽复合物表现出强化的协同抗氧化活性。因此，天然抗氧化剂咖啡酸（CA）与含组氨酸的二肽（组氨酸二肽）进行偶联，以便开发出更好的抗氧化剂。抗氧化活性是采用2,2-二苯基-1-苦味（DPPH）自由基清除能力试验和硫氰酸铁法进行的脂质过氧化试验来测定的。一些CA-His表现出比咖啡酸更好的自由基清除活性，并且，所有的CA-His都显示出增强的脂质过氧化抑制活性。His二肽增强了CA的抗氧化活性，组氨酸的位置也会影响该化合物的抗氧化活性。咖啡酰脯氨酰组氨酸（CA-Pro-His-NH2）在自由基清除试验和脂质过氧化抑制试验中表现出最高活性。

由Elsevier公司2010年出版

氧是地球上最丰富的元素之一，几乎每一个活着的有机体都要消耗氧气而生存。然而，未被消耗的氧分子可以被转换成自由基，如过氧化物，羟基和过氧自由基，它们也被称为活性氧（ROS）。活性氧在人体内发起自由基链式反应，这是造成年纪老化，癌症和由DNA，RNA，脂类及蛋白质氧化损伤而引起的多种慢性疾病的根源。在健康人体内，为了维持机体的平衡，内源性抗氧化剂通过打破自由基链式反应，或者通过转移电子或捕获氢自由基可以消除不断产生的活性氧。如果活性氧过量，平衡被打破，就会导致严重的生命系统的氧化。许多研究人员在各个领域，已经开发了新的合成抗氧化剂来减少活性氧。

酚类化合物作为抗氧化剂被广泛研究，因为这些化合物在自由基淬火后具有稳定的结构。先前的一份报告显示，该酚类化合物的抗氧化活性随着羟基（OH）和甲氧基（OCH3）的数量的增加而增强。咖啡酸（CA的3,4二羟基肉桂酸）

是羟基酸（HCA）这个大家庭中的一员，在自然界是丰富的。CA的高抗氧化活性是由在扩展的共轭侧链中未成对电子的离域造成的。此外，CA的邻二羟基组形成了一个额外的氢键，在O-H键断裂后形成一个稳定的配置。

以抗氧化剂为主的肽也已被积极地研究。抗氧化肽已经通过酶解的方法从各种天然蛋白或人工合成肽库中制备出来了。此外，以往的研究表明，通过脂质过氧化的抑制作用二肽可以增强抗氧化化合物的稳定性。

在我们以前的研究中，HCAs的抗氧化活性是通过抗氧化肽的偶联来增强的。我们得出的结论是，CA-b-Ala-His-NH2是亲水性和疏水性环境中理想的抗氧化剂，因为该化合物表现出较好的自由基清除活性，又协同地抑制脂质过氧化。肌肽（CAR），包含β-丙氨酸和组氨酸，天然地以高浓度（2-20毫米）存在于哺乳动物肌肉组织及神经系统中。CAR延长了成纤维细胞寿命通过扭转老化的迹象和因为组氨酸内咪唑的过氧自由基捕获能力而抑制脂质膜内的脂质过氧化。

方案1.固相CA-His的合成。试剂和条件：(a) Fmoc-L-amino acids (2 equiv), BOP (2 equiv), HOBt (2 equiv) and DIPEA (4 equiv) in NMP for 2 h; (b) 20% piperidine/NMP (v/v) for 3 min and 15 min; (c) repeat (a) and (b); (d) CA (2 equiv), BOP (2 equiv), HOBt (2 equiv) and DIPEA (4 equiv) in NMP for 5 h; (e) cleavage cocktail: 30% TFA/1% water in dry DCM for 1 h, and diethyl ether precipitation.

在这项研究中，我们关注组氨酸残基和建造CA-组氨酸二肽库，以便找到比CA-β-Ala-His-NH2更好的抗氧化剂。几种氨基酸的选择是基于功能组属性。例如，半胱氨酸巯被选中是基其侧链，苯丙氨酸被选择是基于其芳香族侧基，脯氨酸的选定基于其环状结构，丙氨酸被选中是因为它和B-丙氨酸具有相同的分子量，而只有一烷基链不相同。被选定的其他氨基酸选自在天然抗氧化剂中经常出

现的序列。所有组氨酸二肽的C-末端固定成酰胺，因为C-末端肽酰胺比在不同条件下的C -终端自由肽更加稳定。CA-His二肽的抗氧化活性的评价是采用2,2-二苯基- 1 -苦味（清除DPPH）自由基清除试验和亚铁硫氰酸检测的亚油酸自动氧化系统进行的。BHA（丁基羟基;市售的合成抗氧化剂），CA, CA-Phe-NH2, and CA-His-NH2作为参考化合物。

首先，CA-His是通过用方案1合成固相肽的方式来合成的。该化合物是用高纯度和产量高的CA-His合成的（见表1）。

CA-His和CA有相当不同的物理化学性质（表2和3）。CA通过与组氨酸二肽偶联使其分配系数（Log P）减小。偶联后，CA的CLog P (calculated Log P)由于咪唑环中亲水基团的增加而升高。因此，不论组氨酸的位置如何，组氨酸二肽的亲水性增加了CA的水溶性（Log S）。CA-His的分配系数（CLog P）和（CLog S）水溶解度的计算值列于表2和3。

表1. CA-His的产量和纯度

表2. CA-His的分配系数

表3. CA-His的水溶解度

CA, CA-Phe-NH2, CA-His-NH2, CA-His的自由基清除活性通过与DPPH自由基反应而被评价的。图1显示的是％RSA的观测水平。对CA的%RSA的加强是通过与组氨酸二肽偶联实现的，CA -His- NH2在 CA-His衍生物中表现出最高的%RSA。在以下顺序中，一些CA-His表现出比CA更高的%RSA：CA-Pro-His-NH2 (71 ± 3.1) > CA-b-Ala-His-NH2 (70 ± 10.8) > CA-Lys-His-NH2 (65 ± 4.8) > BHA (62 ± 1.0) > CA-Phe-His-NH2 (59 ±3.8) > CA-His-Lys-NH2 (54 ± 5.2) > CA-Asp-His-NH2 (52 ± 3.1) >CA-Phe-NH2 (51 ± 7.7) > CA-His-Asp-NH2 (49 ± 5.8) > CA (47 ± 2.1). CA-His的%RSA同样取决于组氨酸的位置。与组氨酸直接连接到CA（CA- HX）相比，可观察到组氨酸与CA（CA-His）相隔离时有更高的%RSA。

虽然DPPH自由基主要受抗氧化剂的影响，溶剂系统的作用也不能被低估，因为它也有电子基团的捐赠或撤销。一些研究小组已研究了关于酚类抗氧化剂的动力学溶剂效应（KSE）。KSE的大小取决于氢键供体，酚类抗氧化剂以及接受氢的溶剂之间相互作用的强弱。氢键在酚类抗氧化剂的氢原子捐赠活动中扮演了重要作用。当酚类抗氧化剂与自由基相遇时，他们通过氢原子来冷激自由基从而使酚羟基转化为过氧自由基。因此，为RSA的测量而选择的溶剂体系对抗氧化成分的筛选可能非常重要。％RSA在各种不同结构特点的溶剂中测定。甲醇，乙腈和叔丁醇设三种溶剂被选中，因为他们极性相似而结构不同。甲醇是一种被广泛使用的质子极性溶剂，它可以捐出一个质子，从而形成一个既有抗氧化性又有自由基性质的氢键。乙腈是能够形成一个氢键，作为抗氧化氢键受体。叔丁醇是一种有庞大的叔丁基基团的质子极性溶剂，这个基团将导致空间位阻，因此它不能像甲醇那样快的主动地交换质子。图2a显示了在不同的溶剂系统中被选择

的抗氧化化合物的％RSA。

对于三个溶剂体系，％RSA表现为相似的强抗氧化。然而，％RSA的绝对值是有很大不同的，并按以下顺序依次递减：RSA甲醇> RSA乙腈> RSA叔丁醇。正如所料，叔丁醇的％RSA表现最弱，因为它的蓬松阻止了自由基与抗氧化剂的反应。然而，捐赠了质子给自由基。甲醇是一种适当的用来研究抗氧化剂的%RSA的，因为很容易溶剂因为其抗氧化活性很容易比较。所选化合物的%RSA还在酸性条件下进行了测定，以确定pH值对（图2b）的抗氧化活性的影响。一种醋酸缓冲液（pH5.5）被用来制作酸性缓冲甲醇，在以往的研究中它表现出比含部分化合物的甲醇更好的的%RSA。正如所料，缓冲甲醇的%RSA对大部分化合物都比较高。

CA-His抑制脂质过氧化试验是用20吐温的乳化亚油酸（“99％）来做的，以衡量抗氧化活性（图3）。CA-Pro-His-NH2表现了抑制脂质过氧化（％Pi）的最高比例甚至比强烈的合成抗氧化剂BHA还多。在以往的研究中，表现增强的抗氧化活性的CA-Phe-NH2 和只包含组氨酸基团的CA衍生物的CA-His-NH2，被合成，它们的活性与CA-His进行了比较。CA,CA-Phe-NH2, CA-His-NH2, 和 CA-His的%Pi依次为：CA-Pro-His-NH2 (87 ± 6.1) > BHA (86 ± 2.5) > CA-Lys-His-NH2 (84 ± 6.0) % CA-Cys-His-NH2 (84 ± 7.3) % CA-Ala-His-NH2 (84 ± 5.4) > CA-Ser-His-NH2 (83 ± 5.2) > CA-Asp-His-NH2 (82 ±4.5) > CA-Phe-His-NH2 (80 ± 10.9) % CA-His-His-NH2 (80 ± 2.6) >CA-His-Cys-NH2 (79 ± 4.0) > CA-His-Lys-NH2 (76 ± 10.0) > CA-Phe-NH2 (73 ± 8.3) % CA-His-Asp-NH2 (73 ± 2.0) > CA-His-Phe-NH2(72 ± 9.9) > CA-His-Ser-NH2 (71 ± 3.3) % CA-His-b-Ala-NH2 (71 ± 5.1) >CA-His-NH2 (67 ± 4.0) > CA-His-Ala-NH2 (66 ± 12.0) > CA-b-Ala-His-NH2 (64 ± 9.1) > CA-His-Pro-NH2 (61 ± 7.8) > CA (51 ± 9.5).

图1.CA-His的DPPH自由基清除活性。[抗氧化剂] / [清除DPPH]（摩尔/摩尔）=0.25。每个实验分三份，每份做5次。给出的数值是平均值±标准误差。

图2. 不同溶剂体系中所选CA-His的DPPH自由基清除活性。[抗氧化剂]/ [清除DPPH]（摩尔/摩尔）=0.25。每个实验一式三份，重复5次。给出的数值是平均值±标准误差。

图3. 脂质自氧化系统中CA-His在10小时内的抗氧化活性采用硫氰酸铁法测定。条件：每个抗氧化剂最终浓度为90IM, 温度为50℃，黑暗条件下保存10小时。每个实验一式三份，给出的数值是平均值±标准误差。

在CA-His均表现出较CA更高％Pi，与%RSA不同因为化合物的亲水性的差异。DPPH自由基清除试验在亲水性溶剂甲醇中进行，而抑制脂质过氧化试验是在20吐温的双相乳化亚油酸中进行的。表2和表3表明，CA-His比CA有更低的CLog P和CLog S因为CA-His比CA更易溶于水。因此，CA-His可能对脂肪乳剂有很好的辅助功能，因为他们在一个分子中都含有疏水和亲水部分。

DPPH试验的结果表明，肽中组氨酸的位置也会影响CA的抗氧化活性。由于CA-β-Ala-His- NH2的例外，CA-His的%Pi同样的取决于组氨酸的位置（图4）。当一个氨基酸位于组氨酸和CA之间时，%Pi就会升高。

图3显示了在10 h内化合物的脂质过氧化抑制率（％Pi） ，以比较脂质过氧化早期阶段的抗氧化活性。当阴性对照吸光度明显增加时，含CA的反应混合物的吸光度在早期阶段略有增加，然后才敏锐增加。当一个氨基酸，如苯丙氨酸和组氨酸，被结合到CA上时抗氧化活性的增强也被观察到。CA-His表现出比CA-His-NH2更好的活性，因为只有一个组氨酸不能提高CA的抗氧化活性。CA-His具有优异的抗氧化活性，把一些化合物作为强有力的抗氧化剂是有前途的活动。

图4. 在脂质自氧化系统中，CA-His的抗氧化活性与反应时间的函数是用硫氰酸铁法测定的。(a) CA-Ala-His-NH2 (3), CA-His-Ala-NH2 (4); (b) CA-b-Ala-His-NH2 (5), CA-His-b-Ala-NH2 (6); (c) CA-Cys-His-NH2 (7), CA-His-Cys-NH2 (8); (d) CA-Asp-His-NH2

(9), CA-His-Asp-NH2 (10), (e) CA-Phe-His-NH2 (11), CA-His-Phe-NH2 (12); (f) CA-His-His-NH2 (13); (g) CA-Lys-His-NH2 (14), CA-His-Lys-NH2 (15); (h) CA-Pro-His-NH2 (16), CA-His-Pro-NH2 (17); (i) CA-Ser-His-NH2 (18), CA-His-Ser-NH2 (19). 条件：每个抗氧化剂最终浓度为90IM;在黑暗条件下保存,保存温度为50℃。每个实验一式三份，给出的数值是平均值±标准误差。

图5. 建议的(a) CA-Pro-His-NH2 (CA-PH)和(b) CA-His-Pro-NH2 (CA-HP)的分子结构。上述所示的数字由ChemDraw Ultra （CambridgeSoft公司）编写的。

图6. CA和CA – PH（0.1毫米）的黄嘌呤氧化酶抑制活性。每个实验一式三份，给出的数值是平均值±标准误差。

在CA-His肽库中，复合CA-Pro-His-NH2在清除自由基活性测试和抑制脂质过氧化试验中有出色的抗氧化活性。复合CA-Pro-His-NH2由脯氨酸和组氨酸组成，表现出比商业抗氧化剂，BHA更高的%Pi。脯氨酸通常出现在许多作天然抗氧化剂的肽中。 有趣的是，CA-Pro-His-NH2表现出明显的抗氧化活性的增强，然而CA-His-Pro-NH2却表现出不好的抗氧化活性，即使它们的氨基酸组成是相

同的。我们在这里提出一个结构（图5）来解释CA-Pro-His-NH2 和 CA-His-Pro-NH2之间由氨基酸秩序造成的抗氧化活性显著性差异。在建议的结构里，CA-Pro-His-NH2中的脯氨酸提供了一个倾斜的结构，在自由基淬火后通过咪唑环向CA的羟自由基提供额外的稳定性，然而CA-His-Pro-NH2不具备相同的益处结构。

当我们在做DPPH自由基清除试验和抑制脂质过氧化试验时，CA-Pro-His-NH2表现出有前途的活性。对于生物系统中进一步的研究，我们通过一个含有酶和黄嘌呤氧化酶著名的评估系统来审查CA-Pro-His-NH2的抗氧化活性。黄嘌呤氧化酶（XO，EC 1.2.3.2）氧化次黄嘌呤先转变为黄嘌呤，再转变为尿酸，而尿酸一旦积累，就会导致高尿酸血症。当我们在使用改良的Noro方法做XO抑制试验时，CA-Pro-His-NH2就表现出CA的抗氧化活性由52％提高58％的倾向（图6）。

总之，含有组氨酸的二肽偶联到CA上时增强了CA的抗氧化活性。与CA相比，一些化合物由于组氨酸中咪唑的自由基捕获能力表现出比较突出的RSA。所有的化合物较CA具有更好的抑制脂质过氧化活动。CA-Pro-His-NH2在RSA和脂质过氧化的抑制活动中均表现出有良好的效果。因此，CA-Pro-His-NH2在亲水和亲油基系统中均是一种理想的抗氧化剂，这可能是因为脯氨酸的结构能够使组氨酸稳定CA的羟基，从而增强抗氧化活性。

致谢：这项研究论文获得以下各部门和组织的支持和资助：韩国的医疗技术的R&D项目，卫生部，福利及家庭事务部，韩国（A050432）以及由教育部、工程部和技术部资助的韩国科学和工程基金会的WCU（世界级大学）计划。（批准编号R32- 2008- 000-10213- 0） 参考文献及注释（略）