天山樱桃野生居群遗传多样性SSR分析

李春侨;周龙;陆彪;董凯向;刘春燕

【摘 要】为给天山樱桃种质资源的保护和开发利用提供参考,应用SSR标记技术对新疆天山樱桃4个居群44份种质的遗传多样性进行分析.结果表明:筛选的14对SSR引物共检测到191个位点,包含148个多态性位点.Nei’s基因多样性指数和Shannon信息指数分别为0.239 8和0.367 6,各居群遗传分化系数为0.193 5,基因流为2.084 3.天山樱桃遗传分化水平较低,各居群间基因交流频繁,遗传变异主要存在于居群内.由基于遗传距离的聚类结果可知,裕民县与大西沟居群遗传关系最近,与特克斯居群遗传距离较远,4个天山樱桃居群中大西沟居群遗传多样性最高.%In order to provide some references for protection,exploitation and utilization of germplasm resources in Cerasus tianschanica,using 44 germplasm resources from four C.tianschanica populations in Xinjiang as samples,genetic diversity of C tianschanica was researched by using SSR marker technology.The results indicated that 191 loci were detected by 14 pairs of SSR primers,including 148 polymorphic loci.Nei’s genetic diversity index and Shannon’s information index were 0.239 8 and 0.367 6.Genetic differentiation coefficient was 0.193 5,and gene flow was 2.084 3.Genetic differentiation was at a lower level,and the gene exchanged frequently among populations.In addition,the variation was distributed within individuals.The results of cluster based on genetic distance showed Yumin County population had the nearest genetic relation with Daxigou population,and had the farthest genetic distance with Tekes

population.Daxigou population had the highest level of genetic diversity in four C tianschanica populations. 【期刊名称】《经济林研究》 【年(卷),期】2017(035)003 【总页数】6页(P44-49)

【关键词】天山樱桃;遗传多样性;SSR;居群 【作 者】李春侨;周龙;陆彪;董凯向;刘春燕

【作者单位】新疆农业大学林学与园艺学院,新疆乌鲁木齐830052;新疆农业大学林学与园艺学院,新疆乌鲁木齐830052;特克斯县林业局,新疆特克斯835500;新疆农业大学林学与园艺学院,新疆乌鲁木齐830052;新疆农业大学林学与园艺学院,新疆乌鲁木齐830052 【正文语种】中 文 【中图分类】S662.5

天山樱桃Cerasus tianschanica Pojark又称野樱桃，属于蔷薇科Rosaceae樱桃属Cerasus矮生樱亚属植物，目前，在我国仅分布于新疆伊犁和塔城地区[1]。天山樱桃具有抗旱、抗病和根系发达等优点，且矮化效果明显，可作为栽培樱桃的育种材料和优良砧木。我国对于樱桃的研究主要集中在栽培种上，针对种质资源遗传多样性更为丰富的野生樱桃的研究报道较少。利用分子标记技术深入研究天山樱桃的遗传多样性，对充分挖掘和利用野生种质资源具有十分重要的意义。

随着分子生物学技术的快速发展，分子标记技术在种质资源研究方面的应用十分广泛[2-3]。目前，在果树种质资源研究中应用较为广泛的分子标记有RAPD分子标

记[4]、RFLP分子标记[5]和SSR分子标记[6]等，并已取得一定的成果。李单琦等[7]采用ISSR分子标记技术对我国7个福建柏居群进行遗传多样性分析，发现福建柏各居群间基因交流受阻，种群间存在一定的遗传分化，并使用UPGMA法将7个居群分为3类。艾呈祥等[8]使用10对SSR引物进行甜樱桃分子指纹分析，创建数据库，并对不同樱桃种质进行鉴别。骆文华等[9]使用ISSR分子标记对广西火桐的10个自然种群和1个迁地保护种群的遗传多样性和遗传结构进行分析和比较，以期为制定该物种的有效保护措施提供科学依据。

山樱桃作为一种野生种质资源，其应用和发展前景十分广阔，但目前对天山樱桃的研究主要集中在野外资源分布和生物学特性方面，针对天山樱桃遗传多样性的研究尚未见报道。本研究中采用SSR分子标记技术对4个野生居群（特克斯、喀拉峻、大西沟、裕民县）的44份天山樱桃的遗传多样性进行分析，以期揭示其遗传多样性水平和遗传结构，为更好地保护和开发利用天山樱桃种质资源提供参考和理论依据。

于2015年5月初开始对天山樱桃野生居群进行资源调查及样品采集，收集4个野生居群共44份材料用于SSR分析，采样地点详细信息如表1所示。各野生居群地域生殖隔离超过50 km以上，居群内各样株的选择依据不同海拔高度、不同坡向、不同生境类型和不同表型表现，样株相隔不少于500 m，每样株上选择健康枝条的嫩叶20片，装入信封并采用硅胶干燥脱水，带回实验室后置于－70 ℃超低温冰箱保存备用。

叶片基因组DNA的提取方法与陈大明等[10]提取樱桃基因组DNA方法相同。用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外线分光光度计测定DNA完整性、纯度和浓度，适当稀释DNA浓度，贮存于－20 ℃冰箱中备用。

SSR标记反应体系（总体积10 μL）为3.2 μL ddH2O，5 μL MIX，上、下游引物各 0.4 μL，1 μL 模板DNA。MIX由全式金公司生产。PCR反应程序为94 ℃

预变性 4 min，94 ℃变性 30 s，退火 45 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃保温。

PCR扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳70 min，采用银染技术染色[11]，观察记录。

从用于李属开发的55对SSR引物中筛选出重复性强、特异性高且电泳图谱清晰的14对引物进行天山樱桃种质资源遗传多样性分析（见图1），引物由上海生工生物工程有限公司合成，经温度梯度试验确定各引物的最适退火温度（见表2）。 将SSR标记扩增结果（即谱带）转换成数字形式，选择清晰可见的条带记为“1”，无带记为 “0”，建立原始0、1数据矩阵。应用Popgene软件计算观测居群遗传多样性指标，包括多态性位点比率（PPL）、等位基因数（Na），有效等位基因数（Ne），Nei’s基因多样性指数（H）、Shannon信息指数（I）、总的遗传多样性（Ht）、居群内遗传多样性（Hs）和居群间基因分化系数（Gst），及居群遗传结构指标，包括基因流（Nm）、不同居群间Nei’s遗传距离（DG）和遗传一致度（I），并绘制居群间的聚类图，使用PIC CALC软件计算各引物的多态信息含量（PIC）。使用TFPGA软件进行有1 000个随机矩阵的Mantel检测，对遗传距离与地理距离之间的相关性进行分析。

结果描述：SSR分析中，每个引物可扩增得到5～22条DNA片段，平均13.7条（见图1和表3）。14对引物共扩增出191条带，其中148条具有多态性，多态性比率为76.05%，引物的平均多态信息量为0.879。结果表明，SSR标记能够有效揭示材料间的多态性。

不同居群天山樱桃遗传多样性见表4。由表4可以看出，在种内水平上，多态位点百分率为76.05%，观测有效等位基因数为1.785 3，有效等位基因数为1.393 9；在居群水平上，大西沟和裕民县居群多态性比率最高，分别为68.59%和60.21%，喀拉峻居群最低，仅42.41%。4个野生居群的有效等位基因数在1.276 7～1.388

1之间；Nei’s基因多样性指数为0.158 3～0.229 0；Shannon信息指数在0.234 5～0.344 9之间。大西沟居群的遗传多样性较高，多态性位点百分率68.59%，Nei’s基因多样性指数0.229，Shannon信息指数0.344 9。喀拉峻居群的遗传多样性最低。居群水平的Nei’s基因多样性指数和Shannon信息指数分别为0.190 0和0.290 0，在种内水平分别为0.239 8和0.367 6。天山樱桃居群总的遗传多样性为0.236 1，居群内基因多样性指数为0.190 4。

不同居群天山樱桃遗传距离和遗传一致度见表5。经Mantel检测，结果表明，天山樱桃居群间的遗传距离与地理距离之间无显著相关性（r＝0.056 6，p＞0.05）。4个天山樱桃居群间的遗传距离较小，在0.038 6～0.082 3之间；居群遗传一致度（0.921 0～0.962 2）较高，居群间遗传分化系数为0.193 5，表明居群间的遗传分化水平较低；而居群间基因流为2.084 3，表明居群之间存在频繁有效的基因交流，且遗传变异主要存在于居群内。

根据Nei’s遗传距离，应用MEGA3软件采用UPGMA法进行聚类分析（见图2）。由图2可以看出，裕民县居群和大西沟居群的天山樱桃最先聚为一组，表现出较近的遗传关系，然后特克斯居群与喀拉峻居群聚为一组。

SSR分子标记是一种从分子水平上直接揭示物种遗传多样性的技术，应用SSR分子标记探讨樱桃遗传多样性的研究已有报道[12]。本研究中使用14对李属SSR引物对44份天山樱桃进行扩增，发现其多态性百分率为76.05%，平均多态性信息含量为0.879，远高于张琪静等[13]对毛樱桃（多态性信息含量0.52）和左力辉等[14]对中国李资源（多态性信息含量0.698）的研究结果。1980年，Bostsein等[15]提出衡量基因变异程度的多态性信息量指标，当多态性信息含量大于0.5时，该引物为高度多态性信息引物。引物多态性的高低不仅与引物本身有关，还与被检测样本基因组DNA中的简单重复序列有关，使用李属的SSR引物扩增天山樱桃基因组DNA得到较高的引物多态性信息含量，能够更加全面地反映其分子水平多

样性，因此李属的SSR引物能够有效地用于天山樱桃遗传多样性的研究。 Nei’s基因多样性指数和Shannon信息指数是评价种质资源遗传多样性的重要指标，通过Popgene32软件分析，得出Nei’s基因多样性指数为0.239 8，Shannon信息指数为0.367 6，4个遗传多样性指标中Nei’s基因多样性指数和Shannon信息指数均低于山西毛樱桃[16]和李属的杏[17]；由此推断天山樱桃的遗传多样性水平不高，这可能与天山樱桃的繁殖方式有关。在天山樱桃分布区较难发现通过传粉结实形成的实生幼苗，其种群的主要更新方式是萌生更新，生境的破碎化导致天山樱桃零星分布，仅大西沟居群呈现斑块状分布，类型多样，与其它3个群体相比，其遗传多样性较为丰富，因此，今后在对天山樱桃种质资源的保护与开发利用上应以大西沟居群为主。

遗传分化系数是反映居群遗传结构的重要指标，遗传结构则是用来揭示居群内部的分布格局。本研究中天山樱桃居群间遗传分化水平较低，居群间遗传分化系数仅为0.193 5，居群内遗传分化系数为0.806 5，此结果与其它樱属植物基于SSR分子标记的研究结果相似[18-19]。此外，本研究中基因流为2.084 3，根据Slatkin[20]的研究结果，大于1的基因流会抵制遗传漂变作用，防止由此导致的居群遗传分化的发生。4个天山樱桃居群间存在较高的基因交流，阻碍了居群间的遗传分化，致使天山樱桃的遗传分化主要源于居群内。

本研究中根据天山樱桃的Nei’s遗传距离，用非加权算术平均聚类法（UPGMA）进行聚类分析，结果显示，大西沟居群与裕民县居群首先聚为一组，特克斯居群与喀拉峻居群聚为一组，说明大西沟群体与裕民县群体遗传关系较近，而大西沟与裕民县地理距离较远，且有天山阻隔，表明天山樱桃遗传距离与地理距离不相关。经查阅相关资料[21]得知，古代有一条丝绸之路途径裕民县与大西沟，可能因此增加了两地的基因交流，缩小了遗传距离，形成即使有大山阻隔，两地天山樱桃亲缘关系依然较近的格局。

与陈娇等[22]对四川野生中国樱桃遗传多样性的研究结果相比，本研究中有些居群的样株较少，可能无法准确代表居群的遗传多样性水平，因此在保证样株间表型差异较大的同时，样株数量也应尽可能充足。此外，天山樱桃在长期的自然选择下，形成了复杂的遗传结构，使得有些居群尽管分子标记结果相似系数较高，植物学特征却有较大差异，受小生境的影响表现出来的环境饰变较明显，也有些居群分子标记结果相似系数较低，但仍有可能表现出相似的形态特征。所以，今后在天山樱桃种质资源种下类型的分类研究中应采用形态标记与分子标记相结合的方式。 本研究中使用SSR分子标记技术研究了新疆4个天山樱桃野生居群的遗传多样性，结果显示，天山樱桃的多态性位点百分率为76.05%，有效等位基因数为1.393 9，Nei’s基因多样性指数为0.239 8，Shannon信息指数为0.367 6，表明天山樱桃的遗传多样性水平不高，其中大西沟居群的遗传多样性相对较高，喀拉峻居群的遗传多样性最低，居群内的遗传分化高于居群间的，基因交流主要存在于居群内。

【相关文献】

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