HPLC流动相的缓冲液

之欧侯瑞魂创作

HPLC流动相的缓冲液缓冲液流动相可以根据下面的操纵步调配制：将缓冲液药品溶解在水中制成缓冲液（溶液A）。用pH计确定或调节溶液A的pH。将一定体积（如200ml）的有机溶剂B与由步调2配制的溶液A（如800ml）混合，制成最终流动相（此处的有机相为20%）。检查最终流动相的pH（此处为选项）。由于测定含有有机调节剂的流动相pH计发生漂移，使其测定pH不很可靠，所以上面的步调4一般只有在考察误差的主要来源时采取，大多数实验室皆略去此步调。步调1一般是将配制缓冲液所用的两种试剂（A1和A2）分别按计算量先溶解在水中制成水溶液，然后再将这两种溶液按一定的比例混合得到预期pH的溶液A。若在此步调2中调节pH，则可以采取溶剂A滴定溶剂B，也可反过来滴定，并通过pH计丈量得到所需pH的最终缓冲溶液。在大多数实验室中，pH的丈量精度通常不会达到±0.05—0.1个pH单位，这会显著影响一些样品的分离。当HPLC方法对pH非常敏感时，步调2只能大致确定pH值。 将准确称重的缓冲液配制试剂与精确体积的脱气蒸馏水混合，使其成为均一的溶液（不进一步伐整pH），如此配得得缓冲溶液得pH可以控制在非常窄得范围内（±0.02单位），已知准确pH值得缓冲液浓溶液已有市售。 为了改善峰形或塔板数，有时在流动相中加入酸或碱（如三乙胺、乙酸等），如果这些添加剂并不是为配制缓冲溶液时所采取得试剂，那么将这些试剂加入到流动相中后，还需重新滴加酸或碱，使流动相达到所需的pH值。经常使用缓冲液的配制 当缓冲液被稀释或浓缩时，pH也应不变。其pH值应近似恒定不变，或当其中的离解的阳离子（K+、Na+）或阴离子（Cl-、Br-）被其它种类的离子替换时，表1—4中给出了响应的配制方法，平衡阳离子为Na+，缓冲液的最终浓度为0.1mol/l，对于其它浓度的缓冲溶液或阳离子种类（通常K+）更好，表中的数据也可供参考。较稀的或较浓的缓冲溶液，及包含有分歧阳离子的溶液，其pH值会与表中的数据稍有出入。在方法建立过程中，精确的流动相pH值往往其实不重要，重要的是每次新配制的流动相的pH值与第一次基底细同（最好控制在±0.02范围内）。注意，只有当缓冲

溶液的pH在缓冲试剂解离常数pKIa±1范围内时，缓冲溶液才具有有效的缓冲容量（如乙酸盐的pKa=4.6，其适宜的pH范围为3.6—5.6）。表1 低pH值（25℃）磷酸盐缓冲溶液的配制方法溶液A1：0.1M磷酸。配制精确pH值缓冲液时，所用磷酸需滴定H3PO4的含量。溶液A2：0.1M磷酸二氢钠溶液，称量13.8g NaH2PO4·H2O溶解于水中，定容于1L容量瓶中。 pH A1体积（ml） A2体积（ml） pH A1体积（ml） A2体积（ml） 2.0 565 435 2.8 175 825 2.2 455 545 3.0 110 890 2.4 345 655 3.2 55 945 2.6 250 750 表2 分歧pH值（25℃）醋酸缓冲溶液的配制方法溶液A1：0.1M醋酸溶液。6.0g（5.8ml）冰醋酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M醋酸钠溶液。8.2g C2H3O2Na（或13.6g C2H3O2Na·3H2O）溶解于水中定容到1L容量瓶中。 pH A1体积（ml） A2体积（ml） pH A1体积（ml） A2体积（ml） 3.6 926 74 4.8 400 600 3.8 880 120 5.0 296 704 4.0 820 180 5.2 210 790 4.2 736 264 5.4 176 824 4.4 610 390 5.6 96 904 4.6 510 490 表3 分歧pH值（25℃）柠檬酸缓冲溶液的配制方法溶液A1：0.1M柠檬酸溶液。21.0g 柠檬酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M柠檬酸钠溶液。29.4g C6H5O7Na3·2H2O溶解于水中，定容到1L容量瓶中。 pH A1体积（ml） A2体积（ml） pH A1体

积

（

ml

）

A2

体

积

（ml） 3.0 930 70 5.2 360 660 3.2 870 126 5.4 320 680 3.4 810 190 5.6 270 726 3.6 750 260 5.8 230 764 3.8 700 300 6.0 190 810 4.0 660 340 6.2 140 856 4.2 610

370 6.4 60 940 4.4 560 440 6.6 40 960 4.6 510 490 6.8 30 970 4.8 460 540 7.0 10 985 5.0 410 590 表4 中等pH值（25℃）磷酸缓冲液的配制方法溶液A1：0.1M磷酸二氢钠溶液。13.8g NaH2PO4·H2O溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M磷酸氢二钠溶液。26.8g Na2HPO4·7H2O（或35.9g Na2HPO4·12H2O）溶于水中，定容到1L容量瓶中。 pH A1体积（ml） A2体积（ml） pH A1体积（

ml

）

A2

体

积

（ml） 5.6 948 52 7.0 390 610 5.8 920 80 7.2 280 720 6.0 877 123 7.4 190 810 6.2 815 185 7.6 130 870 6.4 735 265 7.8 85 915 6.6 685 315 8.0 53 947 6.8 510 490 表5和6给出了适于pH=7—10.6范围的两种有机碱缓冲液配制方法，这种有机碱缓冲液可以有效低减缓硅胶基柱的柱效降低。表5 高pH（25℃）甘氨酸缓冲溶液的配制方法溶液A1：0.2M甘氨酸。15.01g 甘氨酸溶于水中，定容于1L容量瓶中。溶液A2：0.1M NaOH溶液，稀释较浓的NaOH溶液。 pH A1体积（ml） A2体积（ml） pH A1体积（ml） A2体积（ml） 8.6 25 2.0 9.6 25 11.2 8.8 25 3.0

9.8 25 13.6 9.0 25 4.4 10.0 25 16.0 9.2 25 6.0 10.4 25 19.3 9.4 25 8.4 10.6 25 22.75 表6 高pH值（25℃