乙酰肝素酶对血管内皮细胞增殖、迁移及血管活性因子表达的影响

DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.004

·论著·

乙酰肝素酶对血管内皮细胞增殖、迁移 及血管活性因子表达的影响

王静，吴婵，周睿，岑山，徐斌

【摘要】

目的 检测乙酰肝素酶（HPA）过表达对血管内皮细胞增殖、迁移及血管活性因子表达的影响，进一步揭示 HPA 参与调节动脉粥样硬化斑块内血管新生过程的作用机制。 方法 构建 HPA 基因的过表达载体，转染 HUVEC 细胞。利用 Western blot检测 HPA 蛋白的过表达情况。利用 CCK8 法检测细胞增殖情况，细胞迁移实验检测 HPA 对细胞迁移能力的影响。利用 Western blot 检测 HPA 对 Ang2 和 Tie2 蛋白表达的影响。

结果 构建的 HPA 表达载体转染 HUVEC 细胞后可使 HPA 蛋白水平明显上调。随着转染时间的增加，HPA 转染组的相对增殖率可达对照组的 2 ~ 3 倍。HPA 转染组的穿膜细胞数明显多于对照组。HPA 转染组的 Ang2 和 Tie2 的蛋白表达水平高于对照组。

结论 HPA 过表达可提高 HUVEC 细胞的增殖和迁移能力，促进血管活性分子 Ang2 和 Tie2 的表达，提示 HPA 可能通过调控 Ang2/Tie2 的表达来影响易损斑块内病理性血管新生。

【关键词】 乙酰肝素酶； 病理性血管新生； 血管活

性分子

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2018, 13(3):213-218

缺血性脑卒中具有高发病率、高死亡率、高 致残率以及高复发率的特点，成为威胁人类健康 和生命的主要疾病之一[1-2]。动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）易损斑块破裂及其导致栓子脱落引起血栓形成是导致缺血性脑卒中事件的重要病因之一[3-4]，因此斑块稳定性问题越来越引起人们的重视。病理学研究发现，斑块内病理性血管新生的存在和程度与斑块破裂及临床脑血管事件相关[5]。斑块内病理性新生血管的增多，导致斑块内出血风险增加，高危易损斑块形成，进而引起斑块内不稳定事件链循环往复。Gössl 等[6]发现，尸解冠状动脉粥样硬化斑块可见大量新生血管形成。对人类进展期动脉粥样硬化斑块的研究证明血管新生与易损斑块之间存在明显的相关性[7]。综上所述，

病理性血管新生在易损斑块的发展中发挥着至关

重要的作用。

乙酰肝素酶（heparanase，HPA）是哺乳动物体内唯一能够降解细胞表面及细胞外基质中硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs）的 β-D-葡糖醛酸内切 酶[8-9]。As 易损斑块形成和进展过程中的具体作用机制非常复杂，目前研究显示 HPA 可通过促进斑块内炎性反应、与蛋白水解酶协同作用以及参与血液高凝状态等参与易损斑块形成[10]。肿瘤学研究表明，HPA 可通过降解基底膜和细胞外基质，释放和活化血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及血管生成素（Ang）等多种血管生长因子，进而参与调节血管新生[11-12]。但目前关于 HPA 参与调节 As 斑块内血管新生过程的具体作用机制尚不清楚。

研究表明，HPA 主要表达于 As 斑块中的巨噬细胞，且与斑块内病理性血管新生有着密切联 系[13-14]。鉴于在肿瘤学研究中，HPA 通过释放血管活性因子参与肿瘤血管新生[15-16]，Ang 家族成员可作用于特异受体酪氨酸激酶受体 2（Tie2），参与肿瘤新生血管的形成、延续，影响肿瘤的生长、侵 袭和转移[17-18]。同时，我们前期研究显示，与正常动脉段相比，As 斑块内 HPA 表达及新生血管形成均增多，且 HPA 表达与病理性血管新生密切相关[19-20]。As 斑块内 Tie2 表达增高，且与病理性血管新生呈正相关。我们推测，HPA 可能通过 Ang/Tie2 通路参与调节 As 易损斑块内的血管新生。因此，为了进一步探讨 As 斑块内 HPA 在病理性血管新生过程中的作用机制，本文将通过在血管内皮细胞中上调 HPA 基因的表达，研究其对血

基金项目：北京市自然科学基金市教委科技计划重点项目（KZ2015 10025031）

作者单位：100050 北京，中国医学科学院医药生物技术研究所免疫室（王静、周睿、岑山）；100038 北京，首都医科大学附属复兴医院神经内科（吴婵、徐斌）

通信作者：徐斌，Email：xubincj1992@aliyun.com 收稿日期：2018-02-27

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管内皮细胞的增殖、迁移及多种血管活性因子表达的影响，并期望能为全面理解 HPA 在调控血管新生及寻找干预 As 易损斑块形成和发展的新靶点提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和质粒 HEK293T 细胞为本实验室自有；人脐静脉内皮细胞 HUVEC 由军事医学科学院惠赠；人源 HPA 基因表达质粒通过 PCR 扩增、酶切后连接到 pTT3 真核表达载体获得。 1.1.2 试剂与仪器 DMEM、含 EDTA 的 0.25% 胰酶、FBS 及 Neon 转染系统试剂盒购自美国 Invitrogen 公司；甲醛和结晶紫为本室自有；CCK8 活性测定试剂盒及细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；细胞裂解液购自美国 Promega 公司；HPA 抗体、Tie2 抗体、Ang2 抗体及 β-actin 抗体购自英国 Abcam 公司；辣根酶标记山羊抗小鼠二抗和辣根酶标记山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术公司；增强型化学发光液（ECL）购自美国 Millipore 公司。细胞电转仪 NeonTM Transfection System 购自美国 Invitrogen 公司；荧光显微镜购自德国 Carl Zeiss 公司；680 型 Microplate Reader 酶标仪、PowerPacTM HC Power Supply 蛋白电泳仪、Mini Trans-Blot 蛋白转膜仪及 Gel DocTM XR+ 凝胶成像仪均为美国 Bio-Rad 公司产品。 1.2 方法

1.2.1 HPA 基因表达质粒的构建 在 NCBI 中查找人源 HPA 基因（Genbank AF165154.1）的 CDS 序列（1632 bp），利用基因克隆技术，成功构建以 pTT3 为载体骨架的 HPA 基因真核表达质粒 HPA-Bio-His，经英骏生物技术公司测序鉴定序列正确。

1.2.2 HPA 表达质粒电穿孔转染 HUVEC 细 胞 取对数生长期的 HUVEC 细胞，弃去培养 基，PBS 冲洗 1 次，加入胰酶消化成细胞悬液，细胞悬液以 800 r/min 离心 5 min，弃上清，用 PBS 洗涤一次，离心弃上清，调整细胞密度为 5 × 107 个/ml。电穿孔方法转染采用 Invitrogen NeonTM Transfection System 进行，操作方法参见其使用手册，其中电转仪参数设置为 1100 V，30 ms，2 个电脉冲。

1.2.3 CCK8 法检测细胞增殖 取生长良好的

HUVEC 细胞进行电穿孔转染，转染后的细胞接种于 96 孔板（密度约为 5 × 107 个/ml），设立实验组（转染 HPA 质粒）、对照组（转染空载体）、空白组（不加细胞，只含培养液）、阴性对照组（只含细胞），每组设 8 个复孔。检测时，细胞上清更换为含有 10% CCK8 试剂的细胞培养液，细胞 在 37 ℃、5% 二氧化碳孵箱中继续培养 1 h，使 用 EnSpire 2300 多功能酶标仪检测 450 nm 处光吸收。

1.2.4 Transwell 体外迁移实验 选用 8.0 μm 孔径的 transwell 小室进行实验。取对数生长期 的 HUVEC 细胞，弃去培养基，PBS 冲洗 1 次，加入胰酶消化成细胞悬液，并调整细胞数为 5 × 107 个/ml 进行电穿孔转染实验。设立实验组及对照组，分别电转染 500 ng 空载体和 HPA 质粒。将 100 μl 电转染后的细胞悬液加入 transwell 上室。然后取含有 20% FBS 的 DMEM 培养基 500 μl 加入下室。5% 二氧化碳培养箱 37 ℃ 正 常培养 48 h。棉签擦去上室膜内细胞，甲醛固定 20 min；0.5% 结晶紫室温染色 10 min，双蒸水漂洗至多余颜色除去。Transwell 小室置于显微镜下观察膜下表面细胞，以膜下细胞的数量表示迁移能力，随机选取视野拍照并计数。

1.2.5 Western blot 检测蛋白表达情况 HEK293T 细胞和 HUVEC 细胞分别转染 500 ng 空载体和 HPA 质粒，48 h 后用 80 μl RIPA 细胞裂解液裂解细胞，旋涡振荡后再加入 20 μl 5 × 蛋白上样缓冲液裂解细胞。金属浴 100 ℃ 加热 40 min。取等 量总蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，使用 PVDF 膜 70 V 恒压湿法转膜 1 h 后，5% 脱脂牛奶室温 封闭 1 h。先后与一抗和二抗孵育，最后 ECL 显色。Western blot 条带利用 Image J 软件进行定量分析。

1.3 统计学处理

所得数据以 xs 表示，两组间比较使用双尾的学生 t 检验进行统计学分析，P < 0.05 认为具有统计显著性。

2 结果

2.1 HPA 基因质粒的表达检测

在 HUVEC 细胞中电穿孔转染 HPA-Bio-His 表达质粒或空载体，48 h后收取细胞，提取总蛋白，利用 Western blot 实验检测 HPA 的表达情况。结果显示，与空载体的对照组相比，HPA-Bio-His 表

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HPA β-actin

A

0

空载对照组 HPA 转染组

Vector control HPA transfection B

HPA 相对表达量 Relative protein levels 空载对照组 HPA 转染组 Vector control HPA transfection

2.0

1.5

1.0

0.5

图 1 HPA 在 HUVEC 细胞中的过表达情况（A：HPA 蛋白水平；B： Western blot 条带的定量结果，**P < 0.01）

Figure 1 Overexpression of HPA in HUVEC cells (A: HPA protein level in HUVEC cells; B: Relative quantification of HPA protein in panel A, **P < 0.01)

达质粒能够在 HUVEC 细胞中正确表达（图 1A），且 Western blot 条带的定量分析结果显示， HPA-Bio-His 质粒转染细胞后可使 HPA 蛋白表达量提高 1.5 以上（图 1B），可用于后续 HPA 过表达相关实验的研究。

2.2 HPA 过表达对血管内皮细胞增殖的影响

在 HUVEC 细胞中转染空载体或 HPA 表达质粒，并分别于不同时间点测定细胞活性。结果显示，随着细胞转染后培养天数的增加，细胞活性逐渐增强，但 HPA 过表达后细胞的相对增殖率可达对照组的 2 ~ 3 倍（图 2）。这说明过表达 HPA 可增加 HUVEC 细胞的增殖能力。

2.3 HPA 过表达对血管内皮细胞迁移的影响

在 HUVEC 细胞中转染空载体或 HPA 表达质粒，48 h 后分别检测细胞的迁移情况。结果显示，HPA 过表达后穿膜细胞数高于对照组（图 3A）。在显微镜下随机选择三个视野，计算两组中迁移细

空载对照组 HPA 转染组 Vector control HPA transfection

8

相对增殖率（%） Relative growth rate of cells (%)

6

4

2

0

1 2 3 4 5

感染后天数

Days post-transfection

图 2 HPA 过表达对 HUVEC 细胞增殖能力的影响

Figure 2 Effect of HPA overexpression on the proliferation of HUVEC cells

细胞数目 The number of cells 100806040200

A

空载对照组 HPA 转染组 Vector control HPA transfection

B

图 3 HPA 过表达对 HUVEC 细胞迁移的影响（A：空载对照组和 HPA 转染组 HUVEC 细胞迁移情况；B：3 个随机视野下细胞迁移数的统计结果，*P < 0.05）

Figure 3 Effect of HPA overexpression on the migration of HUVEC cells (A: The migration of HUVEC cells transfected with or without HPA plasmid; B: The amounts of cells from three random selected fields, *P < 0.05)

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Tie2 Ang2 β-actin

蛋白相对表达量 Relative protein levels 空载对照组 HPA 转染组 Vector control HPA transfection

2.52.01.51.00.50

A

空载对照组 HPA 转染组 Vector control HPA transfection

Ang2 β-actin Tie2

空载对照组 HPA 转染组

Vector control HPA transfection B

2.52.01.51.00.50

蛋白相对表达量 Relative protein levels

C

空载对照组 HPA 转染组

Vector control HPA transfection D

图 4 HPA 过表达对 Tie2 和 Ang2 蛋白水平的影响（A：HEK293T 细胞中 Tie2 和 Ang2 的蛋白水平；B：A 图 Western blot 条带的定量结果；C：HUVEC 细胞中 Tie2 和 Ang2 的蛋白水平；B：C 图 Western blot 条带的定量结果；*P < 0.05，**

P < 0.01）

Figure 4 Effect of HPA overexpression on the levels of Tie2 and Ang2 in HEK293T and HUVEC cells (A: Tie2 and Ang2 protein levels in HEK293T cells; B: Relative quantification of each protein in panel A; C: Tie2 and Ang2 protein levels in HUVEC cells; D: Relative quantification of each protein in panel C; *P < 0.05, **P < 0.01)

胞的数量，并利用双尾学生 t 检验的方法进行统计学分析。结果显示 HPA 转染组的穿膜细胞数是对照组的 2 倍左右（图 3B），这表明 HPA 过表达显著促进了 HUVEC 细胞的迁移能力（α = 0.05， P = 0.047）。

2.4 HPA 过表达对血管活性分子表达的影响

分别在HEK293T 和 HUVEC 细胞中过表达 HPA，并检测其对 Ang2 及 Tie2 蛋白表达的影 响。结果显示，在这两种细胞中，HPA 转染组细胞中内源 Tie2 和 Ang2 的蛋白水平均高于对照组（图 4A 和 C）。经 Western blot 条带的定量分析，显示 HPA 转染细胞后可使 Tie2 和 Ang2 蛋白表达量提高 1.5 以上（图 4B和 D），这表明 HPA 过表达可促进细胞内血管活性分子 Tie2 和 Ang2 的表达。

3 讨论

As 易损斑块破裂是一个复杂的病理生理过程，病理性血管新生在 As 斑块进展过程中起着重要作用。我们前期研究显示，HPA 在As 斑块内高表达，且可能促进斑块内病理性血管新生过程，而目前关于 HPA 与新生血管的关系研究多集中于肿瘤学领域。因此，为了明确 HPA 在 As 斑块内血管新生中的作用机制，本文从细胞和分子水平进一步研究了 HPA 基因对新生血管的影响。

本研究在对血管内皮细胞 HUVEC 的生物学行为进行了一系列研究后发现，HPA 过表达的血管内皮细胞具有较高的增殖率和穿膜能力，说明 HPA 与血管内皮细胞的增殖和转移能力密切相关，这与其在促进肿瘤细胞的侵袭和转移方面的功能很相似[21]，该结果揭示了 HPA 在血管新生中具有重要功能。

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血管生成素家族及其酪氨酸激酶受体 Tie1 和 Tie2 可以连通内皮细胞和周围间质，建立相对稳定的细胞生化作用[22]。Tie2 具有促进血管新生及维护血管的双重作用。Ang1 和 Ang2 是 Tie2 特异性配体，它们可以分别激活或转导内皮细胞 Tie2 信号。其中 Ang2 可以通过诱导平滑肌细胞/周细胞丢失来增加内皮细胞对促血管新生因子的敏感性，进而使新形成的血管系统不稳定。本研究发现，HPA 过表达可以促进 Ang2 和 Tie2 等血管活性因子的表达。这提示 HPA 还可能通过 Ang2/Tie2 通路参与调节 As 斑块内的血管新生，但仍需要进一步设计实验，如干扰细胞 Ang2 或 Tie2 情况下检测 HPA 对血管新生的影响等来完善地证实这一结论。

综上所述，本文从上调 HPA 基因表达水平角度出发，证明了HPA与血管内皮细胞的增殖和迁移能力密切相关，同时促进 Ang2 及 Tie2 血管活性分子的表达水平。硫酸甘露糖戊糖硫酸盐（PI-88）可以竞争性抑制 HPA 表达，且动物模型已证实PI-88可抑制血管新生[23-24]。我们后续将利用 HPA 抑制剂 PI-88 从抑制 HPA 表达角度来进一步完善该工作。本部分工作将为探索 HPA 在 As 易损斑块内血管新生过程中的作用机制提供重要的理论依据，同时对促进 As 治疗的药物新靶点的发现具有重要的指导意义。

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Effects of HPA overexpression on the proliferation, invasion and vasoactive factors levels in HUVEC cell line

WANG Jing, WU Chan, ZHOU Rui, CEN Shan, XU Bin

【Abstract】

Objective To explore the effects of HPA overexpression on the proliferation, invasion and vasoactive factors levels in HUVEC cell line and to further reveal the mechanism of HPA involved in the regulation of angiogenesis.

Methods The expression plasmid of human HPA gene was constructed and transfected into HUVEV cells. The overexpression efficiency of the HPA plasmid was assessed by Western blot. Cell counting kit (CCK8) was performed to determine the cell growth and the transwell migration assay was performed to detect the cell migration. The effects of HPA overexpression on Ang2 and Tie2 protein were assessed by Western blot.

Results HPA expression was significantly upregulated in HUVEC cells transfected with the HPA expression plasmid. With the increase of days post-transfection, the relative cell growth rate in the HPA-transfected group was 2-3 folds more than that in the control group. Moreover, the transmembrane cell number and the protein levels of Ang2 and Tie2 were increased in HPA-transfected group.

Conclusion HPA overexpression promotes HUVEC cell proliferation and migration and enhances the expression of Ang2 and Tie2, indicating that HPA may affect the angiogenesis in vulnerable plaques through regulating Ang2 and Tie2 expression. 【Key words】 Heparanase; Angiogenesis; Vasoactive factors

Author Affiliations: Department of Immunology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (WANG Jing, ZHOU Rui, CEN Shan); Department of Neurology (WU Chan, XU Bin), Fuxing Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China Corresponding Author: XU Bin, Email: xubincj1992@aliyun.com

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