琼脂糖凝胶电泳操作标准流程

琼脂糖凝胶电泳操作标准流程

一、实验目得:

琼脂糖凝胶电泳就是常用得检测核酸得方法,具有操作方便、经济快速等优点。DNA琼脂糖凝胶电泳得使用技术仅代表具备操作琼脂糖电泳得能力。

二、实验原理:

琼脂糖凝胶电泳就是常用得用于分离、鉴定DNＡ、ＲＮA分子混合物得方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时得电荷效应与分子筛效应,达到分离混合物得目得。DＮＡ分子在高于其等电点得溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定得电场强度下,DNA分子得迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身得大小与构型就是主要得影响因素。DＮA分子得迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型得ＤＮＡ分子得迁移速度不同。如环形ＤNA分子样品,其中有三种构型得分子:共价闭合环状得超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDＮA)、与线形DＮA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时得迁移速度大小顺序为:cccDNA〉ＩDNＡ>ocＤNA、

影响核酸分子泳动率得因素主要还就是:1、DＮＡ分子大小;2、琼脂糖浓度;３、DＮＡ构想;4、所用得电压;５、琼脂糖种类;6、电泳缓冲液。

核酸电泳中常用得染色剂就是溴化乙锭(ethidｉum bromiｄe EB)。溴化乙锭就是一种扁平分子,可以嵌入核酸双链得配对碱基之间、在紫外线照射ＢＥ-DNA复合物时,出现不同得效应、2５4ｎm得紫外线照射时,灵敏度最高,但对ＤNA损伤严重;360ｎm紫外线照射时,虽然灵敏度较低,但对ＤNＡ损伤小,所以适合对ＤＮA样品得观察与回收等操作。3０

０nm紫外线照射得灵敏度较高,且对ＤNA损伤不就是很大,所以也比较适用。

三、材料、试剂及器具

1、材料:不同大小得基因组片段

2、试剂:Hｉnd III diｇｅｓｔ DNA Marker(分子量标

准)(TaKaRa);D2000(TianGeｎ);琼脂糖;加样缓冲液(6x):溴酚蓝;电泳缓冲液(1×TAE);溴化乙锭(EB);

3、仪器及器具:(1)移液器、吸头、锥形瓶(2)电泳系统:电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。(３)紫外透射仪、微波炉、电子天平

四、操作步骤

1. 器具清洗:首先将配胶、电泳、染胶所需要得器具清洗干净,包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘(EB污染,需独立清洗)、清洗流程为:先用自来水冲洗三次,然后用纯水冲洗三次,最后用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进行胶回收,则还需用７５％酒精对器具进行消毒。

2. 配胶:根据基因组片段大小,配置相应浓度得琼脂糖凝胶、首先将锥形瓶洗干净并加入少量纯水煮沸,然后量取一定量得电泳缓冲液(１×TAE)至锥形瓶中,再称取相应量得琼脂糖倒入锥形瓶中,摇匀并用锡纸封口,最后放入微波炉煮,煮胶得过程中需注意安全,应适当摇匀,防止爆沸。煮好得凝胶需无气泡、色泽均匀。将煮好得凝胶放入６５℃得水浴锅中,待凝胶冷却至6５℃时,及时将凝胶倒入装好得干净模具中。待凝胶完全凝固后,将凝胶小心转移至

４℃冰箱,冷冻3０miｎ,然后拔梳子。此时,凝胶需平整、不漏孔,可以用于电泳检测、

3. 电泳准备:先将干净得电泳槽排放整齐并做好标记,然后把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央,胶孔得方向朝向负极(注意:①放凝胶前,需将胶托底部得凝胶抹干净,防止胶托在电泳槽中滑动;②此时,可顺便观察凝胶就是否漏孔),再往电泳槽中倒入一定量得电泳缓冲液(1×ＴAE)至刚好将凝胶淹没。(注意保持桌面卫生,防止缓冲液洒到桌面)

4. 上样:将样品、6×溴酚蓝按3:1得比例混匀,轻甩后按照规定得顺序上样,上样顺序应与电泳槽上得标记一致,最后点上一定量得Ｌaddｅr、(注意:①上样时必须确保上样顺序正确无误,样品间不混淆,点样后得空管子先放在电泳槽旁边,用于核查;②点样时不戳孔、不外漏、不溢出;③点样时需小心枪头不要碰到凝胶,以免凝胶挪动,若凝胶已经挪动,需等样品完全沉到底部后,再固定凝胶)

5. 电泳:确认已经正确上样后,双手盖上电泳槽盖,接通电泳仪与电泳槽(注意:确认电极正确连接),设置电泳参数:电压:１20Ｖ,电流:30０mA,时间:30min(溴酚蓝跑至胶2/３为宜);注意确认电极、电泳参数完全正确之后,最后按ｓtar键开始电泳。

6. 染胶:电泳结束之后,带上ＰE手套,小心滑出凝胶,把凝胶转移到干净得PE手套上(注意:ＰE手套上应做好标记,确保样品、电泳槽、PＥ手套得标记就是一致),小心地将凝胶放入相应标记得EB染胶盘中,盖上盖子染30miｎ。其中,染胶盘放在ＥB暗房中,ＥB染液得配方为:100ｍl 1×TAE+5ul EＢ染料。(注意:①配制ＥB染液与染胶时需戴上乳胶手套、PＥ手套,必要时可戴上口罩,染胶时动作要轻,防止溅起EB染液;②注意区分EB污染区与非污染区,防止EＢ污染区向非污染区扩散)

7. 凝胶成像:带上ＰE手套,将凝胶从染胶盘中捞出,放在染胶时得那个PE手套上(注意:

捞胶时需小心防止凝胶断裂、滑落,尽量把多余得ＥB染液甩干),将凝胶放入凝胶成像系统中,按照“Taｎon凝胶成像系统操作规程”进行操作拍照。(注意:拍照时需严格区分EB污染区与非污染区,防止EB污染区污染电脑、键盘及鼠标),最后保存胶图信息至规定得文件夹内,命名规则为:日期+姓名+部门+电泳目得。

五、注意事项

电泳中使用得溴化乙锭(EB)为中度毒性、强致癌性物质,务必小心,勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门得ＥB暗房中操作,操作时戴上乳胶手套,必要时戴上PＥ手套与口罩

建议电泳条件:

１2０V,加2µL 6ｘloａding buffeｒ,上样5µL,2０００ｂp marker 5µL

制胶所需试剂量:

小胶:２%,0、6g琼脂糖,３0ｍl 1ｘＴAE

中胶:2%,1g琼脂糖,50mｌ 1xTＡE

大胶:2%,2g琼脂糖,100ｍl 1xＴＡE