５９６· 色 谱 １．２．２质谱备件 第２６卷 羟脯氦酸的传统测定方法是氯胺Ｔ法 ，其 基本原理是：先把含有ＨＹＰ多肽的蛋白质、组织、血 离子源：ＥＳＩ，电喷雾离子化正离子采集模式 （ＥＳＩ ）；质量扫描范围：４０～３００ Ｕ；毛细管电压： 清、腹水或尿液等水解成游离的ＨＹＰ，游离的ＨＹＰ 被氧化后再与对二甲氨基苯甲醛（ＰＤＡＢ）在一定温 度下发生反应，生成红色的吡咯化合物，最后通过分 光光度计比色或其他的方法检测出水解液中ＨＹＰ 的含量。氯胺Ｔ法的特异性差，灵敏度低，影响因 ３．５ ｋＶ；锥孑Ｌ电压：２５ Ｖ；萃取电压：４．０ Ｖ；射频电 压：０．５ Ｖ；源温度：１０３℃；脱溶剂温度：３００℃；脱溶 剂气速度：２８０ Ｌ／ｈ；锥孔反吹气速度：６０ Ｌ／ｈ；选择 离子监测模式（ＳＩＭ），选择离子为ｍ／ｚ １３２和ｍ／ｚ 素较多，目前研究及应用的已不多。 近年来，柱前衍生高效液相色谱法测定ＨＹＰ的 报道较多，但衍生步骤比较繁琐，衍生条件限制较 多 ’ ，而且影响检测的准确性，从而限制了其发展 前景。另外，也有在２００ ｉｌｉｎ波长下直接检测出氨 基酸的报道 。，但检测灵敏度较低，杂质峰干扰较 大。与其他技术相比，高效液相色谱一电喷雾质谱联 用技术（ＨＰＬＣ—ＥＳＩ／ＭＳ）可以提供丰富的结构信息， 显著提高了检测的准确度、灵敏度，操作简单 ’ 。 但利用ＨＰＬＣ—ＥＳＩ／ＭＳ技术测定胶原蛋白中ＨＹＰ 含量的文献报道甚少。我们采用此法测定了胶原蛋 白中的ＨＹＰ，充分利用了液相色谱的分离能力和质 谱的定性定量能力，节省了样品的处理时间和分析 时间 １ 实验部分 １．１仪器与试剂 Ｗａｔｅｒｓ ２６９５分离单元，配有自动进样器；Ｗａ— ｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＯ ２０００质谱检测器，配有电喷雾 电离源（ＥＳＩ）；ＡＬ２０４电子天平（上海梅特勒一托利 多仪器有限公司）；ＭＴＮ一２８００Ｄ型氮吹仪（天津奥 特赛恩斯仪器有限公司）。 Ｌ一羟脯氨酸标准品（纯度≥９８．５％，杰辉生物技 术有限公司），Ｌ一亮氨酸标准品（纯度≥９８．０％，上海 源聚生物科技有限公司），Ｌ一异亮氨酸标准品（纯度 ≥９８，０％，天津市光复精细化工研究所），Ｌ一精氦酸 标准品（纯度≥９８，５％，杰辉生物技术有限公司），茶 氨酸标准品（纯度≥９９，０％，进口）；胶原蛋白美白胶 囊（广东威士雅保健品有限公司）；三氟乙酸（进 口），乙腈、甲醇为色谱纯，盐酸为分析纯；纯净水用 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司的Ｍｉｌｌｉ—Ｏ纯水系统（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ） 制得。 １．２液相色谱一质谱条件 １．２．１ 液相色谱条件 色谱柱为Ｓｐｈｅｒｉｇｅｌ Ｃ 柱（２００ ｍｍ×４，６ ｍｍ， ５ ｔｘｍ，大连江申分离科学科技公司）；流动相为乙 腈一０．０５％三氟乙酸水溶液（体积比为５：９５），流速 为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；柱温为室温；进样体积为１０ Ｌ，以 ０．２ ｍＬ／ｍｉｎ的分流速度进质谱检测器。 １７５。 １．３标准溶液的配制 精密称取５８．５ ｍｇ ＨＹＰ标准品于５０ ｍＬ容量 瓶中，加水溶解定容，得１．１７ ｇ／Ｌ的标准储备液。 精密称取２０．１ ｍｇ茶氨酸标准品于５０ ｍＬ容量瓶 中，加水溶解定容，得０，４０２ ｇ／Ｌ的内标物溶液。精 密吸取不同体积的标准溶液，加入相同体积的内标 物溶液，适量稀释至ＨＹＰ的质量浓度分别为１１．７， ２９．２５，５８．５，８７．７５和１ １７ ｍｇ／Ｌ的标准系列溶液 （其中内标物茶氨酸的质量浓度为８０．４ ｍｇ／Ｌ）。 １．４样品处理 取胶原蛋白美容胶囊５粒，去壳、混匀，精密称 取０．０５２ ０ ｇ，加６ ｍｏｌ／Ｌ盐酸一０．５％苯酚溶液１０ ｍＬ，真空封管，于１ １０℃下水解２４ ｈ，挥干溶 剂 ，加水溶解，加入内标物溶液５ ｍＬ，加水定容 至２５ ｍＬ，过０．４５ ｔｘｍ纤维素微孔滤膜，滤液直接 进高效液相色潜／质谱仪检测。 ２结果与讨论 ２．１流动相和内标物的选择 胶原蛋白水解之后生成多种氨基酸，其中亮氨 酸和异亮氨酸的相对分子质量（Ｍ ）与ＨＹＰ的 都为１３１，其准分子离子峰ｍ／ｚ都为１３２，故需排除 以上两种氨基酸的干扰。本文分别采用不同比例的 乙腈一水、甲醇一水、乙腈一０．０５％甲酸水溶液、乙腈一 ０，０５％三氟乙酸水溶液对ＨＹＰ（５０ ｍｇ／Ｌ）、亮氨酸 （５０ ｍｇ／Ｌ）和异亮氨酸（２５ ｍｇ／Ｌ）标准溶液进行等 度洗脱，意在对这３种氨基酸进行色谱分离，消除干 扰。结果表明，当流动相为乙腈一水、乙腈一０，０５％甲 酸水溶液和乙腈一０．０５％三氟乙酸水溶液（体积比均 为５：９５）时，上述３种氨基酸均能达到基线分离。 流动相为乙腈一０．０５％三氟乙酸水溶液（体积比为５ ：９５）时上述３种氨基酸的ＳＩＭ色谱图见图２。 质谱多采用内标法进行定量测定。茶氨酸是茶 叶中特有的游离氨基酸，不存在于胶原蛋白中，因此 本实验选用茶氨酸作为定量内标。同时，考虑到样 品水解液中可能存在精氨酸，而精氨酸的 与内 标物茶氨酸的 均为ｌ７４，其准分子离子峰ｍ／ｚ 都为１７５。在相同的液相色谱条件下，用上述３种 维普资讯 http://www.cqvip.com 第５期 ＼８§ｐｕｎｑ∞ 夏金根，等：高效液相色谱一质谱联用测定胶原蛋白中的羟脯氨酸 。５９７－ ∞ 鲫 ∞ ∞ ０ Ｊ … Ｕ 图２ （Ｉ）羟脯氨酸、（Ⅱ）亮氨酸和（ｍ）异亮氨酸的 选择离子ｍ／ｚ １３２的质量色谱图 Ｆｉｇ．２ Ｍａｓｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ｍ／ｚ １３２）ｏｆ （１） ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ， （Ⅱ）ｌｅｕ－ ｃｉｎｅ ａｎｄ（ｍ）ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ 流动相对茶氨酸（８０ ｍｇ／Ｌ）和精氨酸（５０ ｍｇ／Ｌ）进 行洗脱，发现当流动相为乙腈一０．０５％ｊ氟乙酸水溶 液（体积比为５：９５）时，茶氨酸与精氨酸能达到较好 的分离（见图３）。 ，／ｍｉ 图３ （１）精氨酸和（Ⅱ）茶氨酸的选择离子 ｍ／ｚ １７５的质量色谱图 Ｆｉｇ．３ Ｍａｓｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ｍ／ｚ １７５）ｏｆ （Ｉ）ａｒｇｉｎｉｎｅ ａｎｄ（Ⅱ）ｔｈｅａｎｉｎｅ 胶原蛋白水解后主要含有各种氨基酸，用质谱 定性定量检测ＨＹＰ时，只需考虑与其 相同的氨 基酸，其他氨基酸的影响很小。每次样品处理完后， 用３～４倍柱容量的乙腈一０．０５％三氟乙酸水溶液 （体积比为９０：ｌＯ）冲洗色谱柱，使其回到初始条件， 避免非极性物质对色谱柱及质谱检测器的影响。 ２．２质谱条件的优化 为了得到ＨＹＰ的最佳质谱响应，提高其灵敏 发，实验中利用流动注射法（ｆｌｏｗ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙ— ｓｉｓ，ＦＩＡ）对其质 参数进行优化。由于ＨＹＰ的结 构中既有亚氨基又有羧基，因此正离子模式和负离 子模式下都应有较好的响应。但经过实验比较，发 现其在正离子模式下的响应更好。根据各质谱参数 对ＨＹＰ响应和裂解方式的影响情况，主要对锥孔电 压进行了调节。本实验考察了在１０，１５，２０，２５，３０ 和３５ Ｖ的锥孔电压下ＨＹＰ的响应信号。结果表 明：锥孔电压为３０ Ｖ时，ＨＹＰ的响应值达到最大； 超过３０ Ｖ后，其响应信号反而减小，碎片离子增加。 适当调节其他质谱条件进一步优化，最后确定了 “１．２．２”节所述的质谱条件。 在优化的质谱条件下，ＨＹＰ标准品（５０ ｍｇ／Ｌ） 的质谱图见图４－ａ，ｍ／ｚ １ ３２为其准分子离子［Ｍ＋ Ｈ］ 。茶氨酸标准品（８０ ｍｇ／Ｌ）的质谱图见图４－ｂ， ｍ／ｚ １７５为其准分子离子［Ｍ＋Ｈ］ 。 ∞ ∞ ∞ ∞ ０ ｌ ’５ ｂ ５０ １Ｏ０ １ ５０ ２００ ２５０ ３００ 图４ （ａ）羟脯氨酸和（ｂ）茶氨酸的选择离子质谱图 Ｆｉｇ．４ ＳＩＭ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ（ａ）ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ａｎｄ（ｂ）ｔｈｅａｎｉｎｅ ２．３线性关系、检出限和定量限 对加有内标的一系列浓度的ＨＹＰ标准溶液进 样检测，每个浓度的试样平行分析３次，用ＨＹＰ与 茶氨酸峰面积比的平均值（ｙ）对ＨＹＰ质量浓度（Ｘ， ｍｇ／Ｌ）做标准曲线，得到线性方程：ｙ＝０．０２７Ｘ一 ０．０ Ｊ１，７—０．９９９ ３；线性范围为１１．７～ｌ１７ ｍｇ／Ｌ。 将ＨＹＰ标准溶液逐级稀释后，测得最低检出限 为０．７ ｇ／Ｌ（ Ⅳ＝３），最低定量限为２．３ ｇ／Ｌ （Ｓ／Ｎ＝１０）。 ２．４重现性实验 平行称取样品粉末５份，按“１．４”节方法进行 处理后测定，ＨＹＰ含量测定结果的相对标准偏差 （ＲＳＤ）为１．８７％。 ２．５加样回收率试验 平行称取胶原蛋白美容胶囊粉末３份，每份约 维普资讯 http://www.cqvip.com
＼８ Ｂｐｃｎｑ≈０三量Ｑ ５９８· 色 谱 ２．６样品分析 第２６卷 ３０ ｍｇ（其中ＨＹＰ的质量分数为３．６３％，约为１．１ ｍｇ）。分别加入１ １７ ｍｇ／Ｌ ＨＹＰ标准溶液５，１０，１５ 内标物茶氨酸（８０ ｍｇ／Ｌ）的选择离子（ｍ／ｚ １７５）的质量色谱图见图５一ａ。实际样品（ＨＹＰ的质 量浓度约为７５ ｍｇ／Ｌ）和加内标（茶氨酸的质量浓 度约为８０ ｍｇ／Ｌ）后该样品的选择离子（ｍ／ｚ １３２， ｍＬ，按“１．４”节所述处理后进行回收试验。每个试 样平行处理５份，可得低、中、高加标水平下的平均 回收率（ｎ＝５）分别为９８．５％（ＲＳＤ＝１．２３％）， ９７．９％（ＲＳＤ＝１．９２％）和１０１．８％（ＲＳＤ＝２．０１％） １７５）的质量色谱图分别见图５－ｂ和图５一Ｃ。 ｌＯＯ ｂ １ＯＯ ／。３ｕＢｐｃ：案０Ａｌ耋ｕ ８Ｏ ８。 ６０ ∞ 鲫 ∞ 柏 如 Ｏ 善 善６０ 案 ４ｏ ４０ ２Ｏ ｌ ２ ｛ ２０ １ ０． Ｏ Ｏ ＿ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ０ １ ２ ｔ／ｍ１ｎ ＼／＼ ｌ Ｌ ３ ４ ５ ６ ７ Ｏ ０ … ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ｔ／ｍ１ｎ ｔ／ｍ１ｎ 图５ （ａ）茶氨酸的选择离子（ｍ／ｚ １７５）、（ｂ）实际样品的选择离子（ｍ／ｚ １３２，１７５）和 （Ｃ）添加内标的实际样品的选择离子（ｍ／ｚ １３２，１７５）的质量色谱图 Ｆｉｇ．５ ＳＩＭ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ｏｆ（ａ）ｔｈｅａｎｉｎｅ（ｍ／ｚ １７５），（ｂ）ａ ｒｅａｌ ｓａｍｐｌｅ（ｍ／ｚ １３２，１７５） ａｎｄ（Ｃ）ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｓｐｉｋｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅａｍｉｎｅ（ｍ／ｚ １３２。１７５） Ｉ．ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏＵｎｅ；２． ａｒｇｉｎｉｎｅ；３．ｔｈｅａｎｉｎｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（魏东，陈文慧．现代中西医 ３ 结语 本文采用高效液相色谱一质谱联用的方法测定 胶原蛋白中ＨＹＰ的含量。该方法的流动相简单，分 析时间短，且无需对样品进行衍生，操作简便，定量 准确，重现性好，抗干扰能力强，可以用于实际样品 的测定。 结合杂志），２００５，１４（Ｉ８）：２ ４７９ ［４］ Ｚｈａｎｇ Ｊ Ｊ，Ｚｅｎｇ Ｑ Ｘ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（张俊 杰，曾庆孝．食品科技），２００４（４）：８３ ［５］ Ｔｉａｎ Ｊ，Ｌｆｉ Ｊ．Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｙ（田静，吕坚．中国药房）， ２００３，Ｉ４（３）：ｌ４５ ［６］ Ｔａｎｇ Ｚ Ｙ，Ｘｉａｏ Ｌ Ｙ．Ｌｉ Ｈ．Ｓｈａａｎｘｉ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏ— ｒａｔｏｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（唐志毅，肖路延，李红．陕西医学检验）， ｌ９９９，ｌ４（２）：３ ［７］ Ｗａｎｇ Ｙ Ｈ，Ｆｅｎｇ Ｊ Ｌ，Ｐａｎ Ｚ Ｑ，ｅｔ ａ１．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ 参考文献： Ｚｈａｎｇ Ｚ Ｑ，Ｚｈａｏ Ｄ Ｘ，Ｙａｎｇ Ｘ Ｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ＆Ｂｉｏｔｉｃ Ｒｅ— Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（王一红，冯家力，潘振球， 等．中国卫生检验杂志），２００６，１６（２）：１６１ ［８］ ［９］ Ｊａｎｄｅｒ Ｇ，Ｎｏｒｒｉｓ Ｓ Ｒ，ＪｏｓｈｉＶ．ｅｔ ａ１．Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００４，３９：４６５ Ｄｉｎｇ Ｙ Ｙ，Ｘｉｅ Ｍ Ｘ，Ｋａｎｇ Ｊ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｏｕｒｃｅｓ（张自强，赵东旭，杨新林．氨基酸和生物资源）， ２００６，２８（１）：５５ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（丁雅韵，谢孟峡，康娟．分析化学），２００２，３０ （４）：４１８ ［２］ Ｚｏｕ Ｘ Ｌ，Ｌｉ Ｙ Ｑ，Ｚｅｎｇ Ｈ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏ— ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（邹晓莉，黎源倩，曾红燕，等．色谱），２００６，２４ （３）：２６３ ［１０］ Ｍｉａｏ Ｈ，Ｙａｎｇ Ｔ，Ｈｕｏ Ｊ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａ— ｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（苗虹，杨涛，霍君生，等．分析化学）， ２０００，２８（９）：１ ０９１ ［３］ Ｗｅｉ Ｄ，Ｃｈｅｎ Ｗ Ｈ Ｍｏｄｅｒｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ
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