(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104703475 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.06.10
(21)申请号 201380047640.1(22)申请日 2013.09.10(30)优先权数据
61/700,054 2012.09.12 US(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2015.03.12
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/US2013/058866 2013.09.10(87)PCT国际申请的公布数据
WO2014/043058 EN 2014.03.20(71)申请人拜尔农作物科学有限合伙人公司
地址美国北卡罗来纳州(72)发明人J·L·里格斯 E·L·S·卡拉
J·W·克勒珀 K·K·S·劳伦斯J·D·C·鲁西(74)专利代理机构北京北翔知识产权代理有限
公司 11285
代理人侯婧 钟守期
权利要求书2页 说明书12页 附图5页
(51)Int.Cl.
A01N 63/02(2006.01)A01P 5/00(2006.01)
(54)发明名称
用于防治植物寄生性线虫的组合物和方法(57)摘要
公开了一种源自坚硬芽孢杆菌细菌且选自分离的生物表面活性剂、分离的蛋白酶、分离的淀粉酶、分离的脂肪酶和分离的纤维素酶的具有抗线虫活性的实体。本公开内容还提供了包含该实体的组合物、制备该实体的方法、防治植物寄生性线虫的方法以及保护植物的方法。
C N 1 0 4 7 0 3 4 7 5 A CN 104703475 A
权 利 要 求 书
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1.一种源自具有抗线虫活性的细菌的具有抗线虫活性的实体，其中所述实体为至少一种选自下列的物质：分离的生物表面活性剂、分离的蛋白酶、分离的淀粉酶、分离的脂肪酶和分离的纤维素酶。
2.权利要求1的实体，其中所述细菌为坚硬芽孢杆菌种。3.权利要求2的实体，其中坚硬芽孢杆菌菌株为菌株GB-126。4.权利要求1至3中任一项的实体，其中所述实体为至少一种可通过包括如下的方法获得的生物表面活性剂：
A.得到其中已生长有细菌的培养基，B.从培养基中沉淀出生物表面活性剂。5.权利要求1至4中任一项的实体，其中所述实体具有针对肾形肾状线虫的抗线虫活性。
6.一种具有抗线虫活性的组合物，所述组合物包含至少一种权利要求1至5的实体。7.权利要求6的组合物，其中所述细菌为坚硬芽孢杆菌种。8.权利要求7的组合物，其中坚硬芽孢杆菌菌株为菌株GB-126。9.权利要求6至8中任一项的组合物，其中所述组合物具有针对肾形肾状线虫的抗线虫活性。
10.权利要求6至9中任一项的组合物，所述组合物包含至少一种分离的生物表面活性剂。
11.权利要求10的组合物，其中所述生物表面活性剂的浓度大于0.5ppm。12.权利要求10至11中任一项的组合物，其中所述生物表面活性剂的浓度为至少1ppm。
13.权利要求10至12中任一项的组合物，其中所述生物表面活性剂的浓度为1至2ppm。
14.权利要求10至12中任一项的组合物，其中所述生物表面活性剂的浓度为至少2ppm。
15.权利要求6至14中任一项的组合物，所述组合物包含至少一种来自其中生长有细菌的培养基的酸性沉淀物。
16.权利要求15的组合物，其中所述至少一种酸性沉淀物可通过包括如下的方法获得：
(a)向其中生长有细菌的培养基中加入酸以产生酸性沉淀物，以及(b)从培养基中分离酸性沉淀物。17.权利要求16的组合物，其中所述培养基通过在包含补充有酵母提取物和葡萄糖的基本盐培养基的锥形瓶内于37℃下使细菌生长48小时而获得。
18.权利要求16至17中任一项的组合物，其中所述至少一种酸性沉淀物通过向培养基中加入无机酸以得到最终2.0的pH而产生。
19.权利要求18的组合物，其中所述无机酸为HCl。20.权利要求16至19中任一项的组合物，其中通过离心和用二氯甲烷或甲醇萃取酸性沉淀物而从培养基中分离所述至少一种酸性沉淀物。
21.一种防治植物寄生性线虫的方法，所述方法为将权利要求15中任一项的实体和/
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权 利 要 求 书
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或权利要求6至20中任一项的组合物施用于植物、种子材料和/或植物生长的区域。
22.权利要求21的方法，其中所述植物寄生性线虫为肾形肾状线虫。23.权利要求21至22中任一项的方法，其中所述植物为棉花。24.一种保护植物的方法，所述方法为将权利要求1至5中任一项的实体和/或权利要求6至20中任一项的组合物施用于植物、种子材料和/或植物生长的区域。
25.一种具有以下特性的坚硬芽孢杆菌培养基提取物：抗线虫活性和/或存在生物表面活性剂。
26.一种具有以下特性的坚硬芽孢杆菌培养基提取物：抗线虫活性和/或选自蛋白酶活性、淀粉酶活性、脂肪酶活性和纤维束酶活性的活性。
27.权利要求1至5中任一项的实体和/或权利要求6至20中任一项的组合物用于保护植物的用途。
28.权利要求1至5中任一项的实体和/或权利要求6至20中任一项的组合物用于防治植物寄生性线虫的用途。
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说 明 书
用于防治植物寄生性线虫的组合物和方法
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相关申请的互相参引
[0002] 本申请要求于2012年9月12日提交的美国临时申请序列号61/700,054的优先权，其全文的内容通过引证的方式纳入本说明书。
[0001]
技术领域
公开了一种源自坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)细菌且选自分离的生物表面活性剂、分离的蛋白酶、分离的淀粉酶、分离的脂肪酶和分离的纤维素酶的具有抗线虫活性的实体。本公开内容还提供了包含该实体的组合物、制备该实体的方法、防治植物寄生性线虫的方法以及保护植物的方法。
[0003]
背景技术
细菌为一类重要的植物寄生性线虫的天然拮抗剂。细菌分布广泛、具有多种作用
模式以及具有广泛的宿主范围(Tian，B等)。它们显示出多种针对线虫的作用模式，包括寄生，产生毒素、抗生素或裂解酶；诱导系统抗性，并促进植物健康(Aatlen，P.M.等；Kerry，B.R.2000；Kerry，B.R.1987；Siddiqui，Z.A.等；Stirling，G.R.1991；Tian，B.等；Van Loon，L.C.等)。此外，细菌可直接与线虫的入口位点接触，并对可影响线虫发育的根系分泌物产生影响(Sikora，R.A.1992)。巴斯德菌属(Pasteuria)、假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)对线虫的生物防治已显示出有前景的潜力(Meyer S.L.F；Siddiqui，Z.A.等；Stirling，G.R.；Tian，B.等)。
[0005] 坚硬芽孢杆菌菌株GB-126为线虫生物防治剂，其最初在以色列以商品名为
[0004]
WP的生物杀线虫剂注册(Blachinsky，D.等；Keren-Zur等)。在黄瓜和
番茄试验区，此制剂显示出降低由根结线虫属(Meloidogyne spp.)所引起的虫瘿指数(Keren-Zur等)。同样，在田间试验条件下，在移植黄瓜的2个月内观测到了对根结线虫属的抑制并且该抑制持续到实验结束(Giannakou，O.I.等，2004)。由坚硬芽孢杆菌GB-126所提供的防治不如土壤熏蒸剂棉隆有效。然而，其与土壤日晒的结合改进了对线虫的防治，并得到类似于使用棉隆的结果(Giannakou，O.I.等2007)。此外，当在温室中评估番茄幼苗内的坚硬芽孢杆菌GB-126时，其将形成的虫瘿降低了91％，将最终的线虫数量降低了76％，并将南方根结线虫(M.incognita)卵的数量降低了45％(Terefe，M.等)。
[0006]
在其他研究中，一种含海藻提取物的坚硬芽孢杆菌制剂(L)能够减
少高尔夫草坪上的螺旋线虫属(Helicotylenchus spp.)和矮化线虫属(Tylenchorhynchus spp.)(Wick，R.L.2006)。此外，已报道坚硬芽孢杆菌与其他线虫生物防治剂的协同作用促进线虫的减少(Mendoza，A.R.等2009)。在香蕉中，对坚硬芽孢杆菌进行了针对香蕉穿孔线虫(R.similis)的评估，并将其与尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和淡紫拟青霉(P.lilacinus)结合施用，从而减少了此迁移性体内寄生线虫的感染(Mendoza，A.R.等2009)。在体外条件下，对坚硬芽孢杆菌进行了针对植物寄生性线虫的香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)的评
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估。坚硬芽孢杆菌产生了生物活性次级代谢物，该次级代谢物对这些线虫幼体有毒并减少了卵的孵化(Mendoza，A.R.等2008)。[0007] 因此，先前的研究已证实了坚硬芽孢杆菌GB-126的生物活性次级代谢物对植物寄生性线虫的拮抗效应。然而，次级代谢物的类型和所涉及的酶的特性以及可能诱导的植物抗性的作用还未评估。如今越来越少的传统杀线虫剂是可用的，且许多可用的杀线虫剂非常昂贵或对环境和使用者不友好。对用于保护植物免受病原线虫的生物方法的鉴定非常适合如今的农业综合虫害管理平台。在配制成商业产品之前，理解生物防治微生物的单一或多种作用模式可有助于优化微生物的生长。用于评估各种次级代谢物的研究可确定在微生物的生长过程中，诸多代谢物中的哪些应被优化。存在可用于优化微生物生长培养基的方法来提高一种代谢物或其他代谢物的产量。
[0008] 本发明的一个目的为提供一种新的具有抗线虫活性的实体，所述实体源自坚硬芽孢杆菌细菌且选自分离的生物表面活性剂、分离的蛋白酶、分离的淀粉酶、分离的脂肪酶和分离的纤维素酶。另一个目的为提供包含该实体的组合物。又一目的为提供制备该实体的方法。
[0009] 再一个目的为提供防治植物寄生性线虫的方法和保护植物的方法。发明内容
在一个方面，本公开内容提供一种新的具有抗线虫活性的实体，所述实体源自坚
硬芽孢杆菌细菌且选自分离的生物表面活性剂、分离的蛋白酶、分离的淀粉酶、分离的脂肪酶和分离的纤维素酶。[0011] 在一个方面，本公开内容提供一种新的具有抗线虫活性的组合物，所述组合物包含至少一种源自坚硬芽孢杆菌细菌且选自分离的生物表面活性剂、分离的蛋白酶、分离的淀粉酶、分离的脂肪酶和分离的纤维素酶的实体。[0012] 在一个方面，本公开内容提供一种坚硬芽孢杆菌培养基的提取物，其具有以下特性：抗线虫活性和存在生物表面活性剂。[0013] 在一个方面，本公开内容提供一种坚硬芽孢杆菌培养基的提取物，其具有以下特性：抗线虫活性以及选自蛋白酶活性、淀粉酶活性、脂肪酶活性和纤维束酶活性的活性。[0014] 在一个方面，本公开内容还提供制备其的方法。
[0015] 本公开内容还提供通过将本文所述的实体或组合物施用于植物、种子材料或植物生长的区域而防治植物寄生性线虫的方法。在一个方面，本公开内容提供通过将本文所述的实体或组合物施用于植物、种子材料或植物生长的区域而保护植物的方法。[0016] 在一个方面，植物寄生性线虫为肾形肾状线虫(Rotlyenchulus reniformis)。
[0010]
附图说明
图1列出了与水和培养基对照相比，100％和50％浓度的坚硬芽孢杆菌代谢物在肾形肾状线虫卵上的效果。
[0017] [0018]
图2列出了与水和培养基对照相比，100％和50％浓度的坚硬芽孢杆菌代谢物在
肾形肾状线虫二龄幼虫上的效果。
[0019] 图3列出了坚硬芽孢杆菌GB-126产生生物表面活性剂的测试。(A)代表煤油的正
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向乳化。(B)代表在血琼脂中由于细胞裂解形成晕圈。(C)代表正向油滴坍缩测试。[0020] 图4列出了在接种30分钟之后，与BP培养基和水对照以及坚硬芽孢杆菌细菌相比，由坚硬芽孢杆菌产生的生物表面活性剂在肾形肾状线虫二龄幼虫上的效果(P≤0.05)。
[0021] 图5列出了在体外条件下，在接种30分钟之后，纯化的由坚硬芽孢杆菌产生的生物表面活性剂在不同浓度(ppm)下在肾形肾状线虫二龄幼虫上的效果(P≤0.05)。[0022] 图6列出了在体外试验中，在SEM下观测到的肾形肾状线虫二龄幼虫外形的照片(对照以及在施用2ppm的坚硬芽孢杆菌生物表面活性剂之后)。[0023] 图7列出了在棉花植株中，在坚硬芽孢杆菌GB-126和粘质沙雷氏菌(S.maracescens)针对肾形肾状线虫的系统抗性试验之后的棉花植株生长的照片。[0024] 图8列出了坚硬芽孢杆菌GB-126的酶反应测试：(A)代表产生蛋白酶，(B)代表产生淀粉酶，(C)代表产生纤维素酶以及(D)代表产生几丁质酶。[0025] 图9列出了在温室条件下在高温灭菌的土壤中，经7×106cfu/种子的坚硬芽孢杆菌GB-126处理的棉花种子的肾形肾状线虫的生命阶段(P≤0.05)。
具体实施方式
[0026] 在一个方面，本公开内容提供一种新的源自坚硬芽孢杆菌细菌且选自分离的生物表面活性剂、分离的蛋白酶、分离的淀粉酶、分离的脂肪酶和分离的纤维素酶的具有抗线虫活性的实体。
[0027] 抗线虫活性理解为意指任何用于防治或杀灭线虫的活性，如减少线虫卵的孵化或麻痹线虫幼体。通过实验室和温室操作均可在体外和体内进行抗线虫活性的测试。体外测试可包括在小的96-孔板上在选择性培养基中测试卵和/或幼体线虫并且通过显微镜评估完成测量。结合合适的防治处理以监控和比较活性。在温室研究下，在130℃和1.0kg/cm3的压力下，使用两个90分钟的循环并在循环之间用24小时的冷却对土壤进行高温灭菌，以除去任何微生物区系的天然竞争。通过改进的重力筛选法和蔗糖离心浮选法从土壤中提取蠕虫状阶段。通过在1％的NaOCl溶液中以120rpm摇动根系四分钟从棉花根中提取卵阶段。通过25μm的筛子收集并用水清洗线虫悬浮液。根中的雌虫用酸性品红染色，从而有助于对侵入根部雌虫的计量。所测试的变量包括植株高度、幼苗和根的重量、每克根中的雌虫和卵以及在土壤中的蠕虫状生命阶段的数量。[0028] 在一个方面，坚硬芽孢杆菌的菌株为GB-126。在一个方面，本文所述实体具有针对下列线虫的抗线虫活性：肾状线虫(肾形线虫属(Rotlyenchulus spp.))、剑线虫(剑线虫属(Xiphinema spp.))、矛线虫(Lance nematode)(纽带线虫属(Hoplolaimus spp.))、针线虫(针线虫属(Paratylenchus spp.))、环形线虫(轮线虫属(Criconemoides spp.))、根结线虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.))、鞘线虫(鞘线虫属(Hemicycliophora spp.))、螺旋线虫(螺旋线虫属(Helicotylenchus spp.))、短粗根线虫(毛刺线虫属(Trichodorus spp.))、胞囊线虫(胞囊线虫属(Heterodera spp.))、针刺线虫(针刺线虫属(Belonolaimus spp.))和/或矮化线虫(矮化线虫属(Tylenchorhynchus spp.))。在一个方面，本文所述实体为生物表面活性剂，其可通过包括如下的方法获得：得
到其中生长有坚硬芽孢杆菌细菌的培养基，以及从培养基中沉淀出生物表面活性剂。
[0029]
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生物表面活性剂理解为意指由微生物产生的表面活性化合物。它们为既具有亲水性区域又具有疏水性区域的两性分子，从而使其在具有不同极性的流体(如水和烃)之间的界面处聚集(Jennings E.R.等，2000)。
[0031] 进行多次初步测试以确定从坚硬芽孢杆菌中产生了生物表面活性剂。细菌在血琼脂中生长，其中生物表面活性剂的正向产生通过细菌菌落周围的透明晕圈来指示。其他测试，将坚硬芽孢杆菌在营养肉汤中于30℃下培养24小时。随后，通过在5,181xg下离心15分钟回收活细胞，并将细胞用0.85％(w/v)NaCl洗涤两次，然后悬浮于5ml的0.85％(w/v)NaCl中。其用于以1％(v/v)的接种比向45ml的含盐Davis基本肉汤接种。所述含盐Davis基本肉汤的组成为K2HPO45.23g/l、KH2PO41.91g/l、MgSO40.09g/l、(NH4)2SO41g/l以及1ml/l的痕量元素溶液(CoCl320mg/l、H3BO330mg/l、ZnSO410mg/l、Cu2SO41mg/l、Na2MoO43mg/l、FeSO410mg/l和MgSO42.6mg/l)。将培养物在150rpm下于30℃±2培养3天。再次通过离心(在4000xg下20分钟)从上清液中分离坚硬芽孢杆菌活细胞。通过0.45至0.22μm的Millipore过滤器过滤上清液以得到最终的细菌生物表面活性剂产品。在120℃和1kg/cm3的压力下，将此最终产品高温灭菌30分钟两次以杀死所有细菌的活细胞并使其酶失活。通过将0.5ml上清液和0.5ml煤油以及4ml蒸馏水于一次性培养管(硼硅酸盐玻璃16×150mm)中混合以评估无细胞上清液的乳化活性。阴性对照由蒸馏水和煤油组成，而阳性对照由蒸馏水、煤油和Triton X-100(100mg/ml)组成。每根管均用振摇器振摇1分钟并静置24小时。然后以毫米为单位测量乳化圈的高度并将其与化学乳化剂的乳化圈高度比较。如果存在表面活性剂的正向产生，则煤油使其乳化并产生泡沫。第三次测试由油滴的坍缩组成，其中将一滴上清液置于封口膜纸上并将一滴油置于上清液上。与培养基对照相比，如果油滴直径增大，则认为细菌产生了生物表面活性剂。最后，在体外条件下在96孔板上，针对肾形肾状线虫二龄幼虫再次对生物表面活性剂产物进行测试。向每孔转移100μL体积的处理液，其包含约16只肾形肾状线虫幼虫。此试验的处理液为i)水对照、ii)BMP对照、iii)生物表面活性剂100％以及iv)坚硬芽孢杆菌15×107cfu/ml。每种处理重复8次，且整个试验重复两次。在接种之后的30分钟记录麻痹或死亡的幼虫数量。在SAS 9.1(SAS Institute Inc.)上分析数据。[0032] 在一个方面，通过在培养基中好氧培养坚硬芽孢杆菌细菌而获得其中生长有坚硬芽孢杆菌细菌的培养基。细菌可在多种培养基中生长，例如补充有酵母提取物和葡萄糖的基本盐培养基。在一个方面，对于生物表面活性剂的分离，通过离心从含表面活性剂的培养基中除去细菌细胞，并且通过加入酸从上清液中沉淀生物表面活性剂。酸性沉淀物通过离心回收并用溶剂萃取。在用酸沉淀之后，将溶解于溶液中的粗组分蒸发，并将最终纯化的生物表面活性剂产品以特定的浓度在蒸馏水中稀释。[0033] 在一个方面，本文所述实体为分离的蛋白酶。蛋白酶理解为意指任何具有蛋白酶活性的多肽或多肽的复合物或多肽的片段。蛋白酶的产生通过使用牛奶琼脂法进行评估。记录跟踪24小时培养期间的清晰晕圈作为蛋白酶产生的正向指示。[0034] 在一个方面，本文所述实体为分离的淀粉酶。淀粉酶理解为意指任何具有淀粉酶活性的多肽或多肽的复合物或多肽的片段。淀粉酶的产生通过使用淀粉琼脂法进行评估。记录跟踪24小时培养期间的清晰晕圈作为淀粉酶产生的正向指示。[0035] 在一个方面，本文所述实体为分离的脂肪酶。脂肪酶理解为意指任何具有脂肪酶
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活性的多肽或多肽的复合物或多肽的片段。脂肪酶的产生通过使用三丁酸甘油酯琼脂法进行评估。记录跟踪24小时培养期间的清晰晕圈作为脂肪酶产生的正向指示。[0036] 在一个方面，本文所述实体为分离的纤维素酶。纤维素酶理解为意指任何具有纤维素酶活性的多肽或多肽的复合物或多肽的片段。纤维素酶的产生通过使用羧甲基纤维素(CMC)琼脂琼脂法进行评估。记录跟踪24小时培养期间的清晰晕圈作为纤维素酶产生的正向指示。
[0037] 在一个方面，本公开内容提供一种新的具有抗线虫活性的组合物，所述组合物包含至少一种源自坚硬芽孢杆菌细菌且选自分离的生物表面活性剂、分离的蛋白酶、分离的淀粉酶、分离的脂肪酶和分离的纤维素酶的实体。[0038] 在一个方面，坚硬芽孢杆菌的菌株为GB-126。在一个方面，本文所述组合物具有针对肾形肾状线虫的抗线虫活性。[0039] 在一个方面，本文所述组合物包含从其中生长有坚硬芽孢杆菌细菌的培养基中分离的酸性沉淀物。在一个方面，本文所述酸性沉淀物可通过包括如下的方法获得：向其中已生长有坚硬芽孢杆菌细菌的培养基中加入酸以产生酸性沉淀物，以及(b)从培养基中分离酸性沉淀物。在另一方面，所述酸性沉淀物具有抗线虫活性。[0040] 在一个方面，通过在培养基中好养培养坚硬芽孢杆菌细菌来获得其中已生长有坚硬芽孢杆菌细菌的培养基。细菌可在多种培养基中生长，例如补充有酵母提取物和葡萄糖的基本盐培养基。在一个方面，对于生物表面活性剂的分离，通过离心从含表面活性剂的培养基中除去细菌细胞，并且通过加入酸从上清液中沉淀生物表面活性剂。酸性沉淀物通过离心回收并用溶剂萃取。在用酸沉淀之后，将溶解于溶液中的粗组分蒸发，并将最终纯化的生物表面活性剂产品以特定的浓度在蒸馏水中稀释。[0041] 在一个方面，本文所述组合物包含分离的生物表面活性剂。在一个方面，本文所述组合物中的分离的生物表面活性剂的浓度大于0.5ppm。在一个方面，本文所述组合物中的分离的生物表面活性剂的浓度至少为1ppm。在一个方面，本文所述组合物中的分离的生物表面活性剂的浓度为1至2ppm。在一个方面，本文所述组合物中的分离的生物表面活性剂的浓度至少为2ppm。在一个方面，本文所述组合物中的分离的生物表面活性剂的浓度为1至5ppm。在一个方面，本文所述组合物中的分离的生物表面活性剂的浓度为2至5ppm。[0042] 在一个方面，本文所述组合物为分离的蛋白酶。[0043] 在一个方面，本文所述组合物为分离的淀粉酶。[0044] 在一个方面，本文所述组合物为分离的脂肪酶。[0045] 在一个方面，本文所述组合物为分离的纤维素酶。[0046] 在一个方面，本公开内容提供一种坚硬芽孢杆菌培养基的提取物，其具有以下特性：抗线虫活性和存在生物表面活性剂。[0047] 在一个方面，本公开内容提供一种坚硬芽孢杆菌培养基的提取物，其具有以下特性：抗线虫活性以及选自蛋白酶活性、淀粉酶活性、脂肪酶活性和纤维束酶活性的活性。[0048] 提取物应指从参考材料中提取的任何组分。
本公开内容还提供通过将本文所述的实体或组合物施用于植物、种子材料(例
如，谷物、种子或无性繁殖器官(如块茎)或有芽的苗部位)或植物生长的区域(例如耕作区域)而防治植物寄生性线虫的方法。
[0049]
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在一个方面，本公开内容提供通过将本文所述的实体或组合物施用于植物、种子材料或植物生长的区域而保护植物的方法。
[0051] 所有的植物和植物部位均可根据本发明进行处理。在本文的上下文中，植物应理解为意指所有的植物和植物种群，例如需要和不需要的野生植物或农作物(包括天然存在的作物)。农作物可为可通过常规植物育种和优化方法或通过生物技术和重组方法或通过这些方法的结合而获得的植物，包括转基因植物以及包括受植物育种者的权利保护或不保护的植物品种。植物部位应理解为意指所有地上和地下的植物部位以及植物的器官如苗、叶、花和根，可提及的实例有叶、针叶、茎、树干、花、子实体、果实、种子、根、块茎和根茎。植物部位还包含无性和有性繁殖材料，例如插枝、块茎、根茎、幼苗和种子。[0052] 在一个方面，植物选自农作物、玉米(田间玉米、种子和爆花用玉米)、高粱、小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、禾本科牧草、大豆、油菜、花生、棉花、苜蓿、果菜类蔬菜(胡椒和番茄)、甜瓜、笋瓜(squash)、南瓜、黄瓜和马铃薯。[0053] 在一个方面，植物寄生性线虫为肾状线虫(肾形线虫属)、剑线虫(剑线虫属)、矛线虫(纽带线虫属)、针线虫(针线虫属)、环形线虫(轮线虫属)、根结线虫(根结线虫属)、鞘线虫(鞘线虫属)、螺旋线虫(螺旋线虫属)、短粗根线虫(毛刺线虫属)、胞囊线虫(胞囊线虫属)、针刺线虫(针刺线虫属)和/或矮化线虫(矮化线虫属)的抗线虫活性。[0054] 在一个方面，植物为棉花。在一个方面，植物为农作物。在一个方面，植物为玉米(田间玉米、种子和爆花用玉米)。在一个方面，植物为高粱。在一个方面，植物为小麦。在一个方面，植物为大麦。在一个方面，植物为黑麦。在一个方面，植物为燕麦。在一个方面，植物为水稻。在一个方面，植物为禾本科牧草。在一个方面，植物为大豆。在一个方面，植物为油菜。在一个方面，植物为花生。在一个方面，植物为棉花。在一个方面，植物为苜蓿。在一个方面，植物为果菜类蔬菜(胡椒和番茄)。在一个方面，植物为甜瓜。在一个方面，植物为笋瓜。在一个方面，植物为南瓜。在一个方面，植物为黄瓜。在一个方面，植物为马铃薯。
[0055] 以下实施例用于说明本公开内容的某些方面而并不旨在限制本公开内容。[0056] 实施例
[0057] 肾形肾状线虫的体外测试[0058] 进行初步测试以评估由坚硬芽孢杆菌所产生的代谢物对肾形肾状线虫二龄幼虫和卵孵化的效果。通过在1％的NaOCl溶液中以120rpm振摇根系四分钟而从棉花根中提取肾形肾状线虫的卵。通过25μm的筛子(8)收集卵的悬浮液并用水清洗。将卵用链霉素硫酸盐(300mg/L)和金霉素(12.5mg/L)清洗以杀灭细菌，然后用甲霜灵(25mL/L)和异菌脲(20mL/L)清洗以杀灭真菌，最后用蒸馏水清洗。关于二龄幼虫试验，在27℃下将卵置于改进的载片加热托盘上的Baerman盘内。三天后孵化出二龄幼虫。为了得到细菌代谢物，使坚硬芽孢杆菌GB-126在50ml的胰酪胨大豆肉汤(TSB)(BACTOTM)中生长四天，然后置于50ml塑料管内并在4000xg下离心20分钟。收集上清液并通过0.45至0.22μm的Millipore过滤器过滤以得到最终的细菌代谢物产物(CFE)。体外试验在96-孔板上进行，其中向每个孔转移100μL体积的处理液，所述处理液含有约16只肾形肾状线虫的幼虫或20只肾形肾状线虫的卵。处理液为i)水对照、ii)TSB培养基对照、iii)代谢物100％以及iv)代谢物50％。每种处理重复6次，且整个试验重复两次。在接种之后的0、24、48和72小时记录孵
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化出幼虫的卵的数量。对于二龄幼虫，在接种之后的0、1、2、4、6和12小时记录移动和被麻痹的线虫的数量。在SAS 9.1(SAS Institute Inc.)上用GLIMMIX程序分析数据，其中分布假设用斯图登平板图(student panel graphs)评估。用Dunnett’s选项评估水和TSB对照之间的差异。
[0059] 表1证实了图1的统计显著性。[0060] 表1
[0061]
表2证实了图2的统计显著性。
[0063] 表2
[0062] [0064]
[0065]
坚硬芽孢杆菌的酶特性[0067] 评估坚硬芽孢杆菌GB-126的不同的酶特性以测试它们降解不同培养基的能力。当在细菌培养物周围形成透明的晕圈时，酶的产生评估为正向。使坚硬芽孢杆菌GB-126在牛奶琼脂中生长24小时以测试蛋白酶的产生、在淀粉琼脂中生长24小时以测试淀粉酶的产生、在羧甲基纤维素(CMC)琼脂中生长24小时以测试纤维素酶的产生、在几丁质酶琼脂中生长24小时以测试几丁质酶的产生以及在三丁酸甘油酯琼脂中生长24小时以测试脂肪酶的产生。CMC琼脂和几丁质酶琼脂需要施用5ml的刚果红来将培养基和在培养细菌24小时之后出现的透明晕圈染色。在淀粉培养基的情况下，培养物用鲁哥试剂染色。[0068] 由坚硬芽孢杆菌产生的生物表面活性剂的确定[0069] 进行三次初步测试以确定从坚硬芽孢杆菌中产生了生物表面活性剂。在第一次测试中，细菌在血琼脂中生长，其中生物表面活性剂的正向产生通过细菌菌落周围透明的晕圈来指示。对于第二和第三次测试，将坚硬芽孢杆菌在营养肉汤中在30℃下培养24小时。随后，通过在5,181xg下离心15分钟回收活细胞，并将细胞用0.85％(w/v)的NaCl洗涤
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两次然后悬浮于5ml的0.85％(w/v)的NaCl中。其用于以接种比1％(v/v)向45ml的含盐Davis基本肉汤接种。所述含盐Davis基本肉汤的组成为K2HPO45.23g/l、KH2PO41.91g/l、MgSO40.09g/l、(NH4)2SO41g/l以及1ml/l的痕量元素溶液(CoCl320mg/l、H3BO330mg/l、ZnSO410mg/l、Cu2SO41mg/l、Na2MoO43mg/l、FeSO410mg/l和MgSO42.6mg/l)。培养物在30℃±2和150rpm下培养3天。再次通过离心(在4000xg下20分钟)从上清液中分离坚硬芽孢杆菌活细胞。上清液通过0.45至0.22μm Millipore过滤器过滤以得到最终的细菌表面活性剂产物。在120℃和1kg/cm3的压力下，将此最终产物高温灭菌30分钟两次以杀死所有的细菌活细胞并使其酶失活。[0070] 在第二次测试中，通过将0.5ml上清液和0.5ml煤油以及4ml蒸馏水在一次性培养管(硼硅酸盐玻璃16×150mm)内混合以评估无细胞上清液的乳化活性。阴性对照由蒸馏水和煤油组成，而阳性对照由蒸馏水、煤油和Triton X-100(100mg/ml)组成。每根管均用振摇器振摇1分钟并静置24小时。然后以毫米为单位测量乳化圈的高度并将其与化学乳化剂的乳化圈高度比较。如果存在表面活性剂的正向产生，则煤油使其乳化并产生泡沫。第三次测试由油滴的坍缩组成，其中将一滴上清液置于封口膜纸上并将一滴油置于上清液上。与培养基对照相比，如果油滴直径增大，则认为细菌产生了生物表面活性剂。[0071] 最后，在体外条件下在96孔板上，再次针对肾形肾状线虫二龄幼虫对生物表面活性剂产物进行测试。向每孔转移100μL体积的处理液，其包含约16只肾形肾状线虫幼虫。此试验的处理液为i)水对照、ii)BMP对照、iii)生物表面活性剂100％以及iv)坚硬芽孢杆菌15x 107cfu/ml。每种处理重复8次，且整个试验重复两次。在接种之后的30分钟记录被麻痹或死亡的幼虫数量。如上所述用SAS 9.1(SAS Institute Inc.)分析数据。[0072] 生物表面活性剂的纯化和制备以及在不同浓度下对肾形肾状线虫的评估[0073] 为制备生物表面活性剂，坚硬芽孢杆菌GB-126在包含(每升)下列的基本盐培养基上好氧生长：KH2PO4(2.0g)、K2HPO4(5.0g)、(NH4)2SO4(3.0g)、NaNO3(2.0g)、NaCl(0.1g)、MgSO4H2O(0.2g)、FeSO47H2O(0.01g)、CaCl2(0.01g)和1ml/l的痕量元素溶液的。痕量元素储备溶液包含(每升)ZnSO47H2O(2.32g)、MnSO44H2O(1.78g)、H3BO3(0.56g)、CuSO45H2O(1g)、Na2MoO47H2O(0.39g)、CoCl26H2O(0.42g)、EDTA(1g)、NiCl26H2O(0.004g)和KI(0.66g)。用0.05％的酵母提取物补充培养基(Vater，J.等)。加入浓度为2％(重量/体积)的葡萄糖作为碳源。培养基的pH为7.1至7.2。有机体在2升含有800ml培养基的锥形瓶内于37℃下生长48小时，并在震荡恒温箱中于200rpm下振摇。[0074] 为分离生物表面活性剂，通过离心(13000x g，于4℃下持续15分钟)从含表面活性剂的培养基中除去细菌细胞。通过加入6N HCl得到最终2.0的pH而从上清液中沉淀生物表面活性剂。酸性沉淀物通过离心(13000x g，于4℃下持续15分钟)回收并用二氯甲烷或甲醇(脂肽类组分)萃取。当使用甲醇作为溶剂时，立即中和萃取液以避免形成甲酯。在用HCl沉淀之后，将溶解于甲醇或二氯甲烷中的粗组分在真空泵(Model Gem 8890)下用旋转蒸发仪(Model Buchi R)蒸发(Vater，J.等)。将最终纯化的生物表面活性剂产物用蒸馏水稀释到浓度2ppm、1ppm、0.5ppm、0.2ppm、0.1ppm和0.02ppm。与上述在二龄幼虫的体外条件下的蒸馏水对照相比，这些浓度采用每种处理重复8次进行评估并重复两次。温室试验[0076] 为评估坚硬芽孢杆菌GB-126是否诱导系统抗性，用分开的根系统测试以下
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处理液。处理液由以下组成：i)无线虫的水对照、ii)有线虫的水对照、iii)坚硬芽孢杆菌1×107cfu/ml、iv)坚硬芽孢杆菌1×106cfu/ml或v)粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)1×107cfu/ml。在温室条件下在盆栽混合土壤中使Stoneville 5458B2RF棉花种子发芽。将新出现的长度约为2.5cm的根系用雷蛇(razer)刀片分开。在种植5天后(DAP)，将土壤从根上移除并分为两等份。将植株种植于960cm3的花盆内并使每半部分根处于不同的杯中。在分开根后的7天，将50ml处理液的悬浮液施用于根的左侧。五天之后，用500只肾形肾状线虫二龄幼虫向根的右侧接种。45DAP收获该试验，并测量植株高度、根部鲜重以及每克根中雌虫和卵的数量。每种处理重复6次，且整个试验重复两次。[0077] 为评估肾形肾状线虫对经坚硬芽孢杆菌GB-126处理的棉花种子的反应，在奥本大学的植物科学研究中心(PSRC)中进行了在高温灭菌土壤中的试验。由制造商在液体拌种机Hege11(Hege Maschinen GmbH，德国)中采用坚硬芽孢杆菌GB-126处理来自栽培品种Stoneville 5458B2RF的棉花种子。通过在调节至pH 8.0的胰酪胨大豆琼脂(TSA)上培养经处理的种子，并记录16小时之后的生长来确认种子中存在的细菌。该土壤为出自位于阿拉巴马州Belle Mina附近的田纳西河流域研究和推广中心(Tennessee Valley Research and Extension Center(TVREC))的迪凯特粉砂质黏壤土(沙-泥-粘土：17.5-51.3-31.2％；氮：0.16％；有机物质：2.2；pH 7.24)。在130℃和15psi下使用两个90分钟的循环并在循环之间用24小时的冷却来对土壤进行高温灭菌。种子处理如下：i)未处理的有线虫的种子；ii)吡虫啉(500g ai/100kg)标准杀虫剂；iii)坚硬芽孢杆菌(7×104cfu/种子)加吡虫啉(500g ai/100kg)；iv)坚硬芽孢杆菌(7×105cfu/种子)加吡虫啉(500g ai/100kg)和v)坚硬芽孢杆菌(7×106cfu/种子)加吡虫啉(500g ai/100kg)。包含标准杀虫剂种子处理液吡虫啉是因为此杀虫剂通常作为种子处理液施用，并对其进行测试以确定其在坚硬芽孢杆菌或肾形肾状线虫的生命阶段是否具有任何效果。
[0078] 通过改进的重力筛选法和蔗糖离心浮选法从土壤中提取肾形肾状线虫的蠕虫状生命阶段。通过在1％的NaOCl溶液中以120rpm摇动根系四分钟从棉花根中提取卵。在25μm的筛子上用水清洗并收集线虫悬浮液。根中的雌虫用酸性品红染色从而有助于对侵入根部雌虫的计量。在倒置的TS 100 Nikon显微镜下于40x放大倍数下计数蠕虫状生命阶段和卵。利用Nikon SMZ800复式显微镜在5x放大倍数下定量嵌入到根系中的雌虫。所测量的变量包括植株高度、幼苗和根的重量、每克根中的雌虫和卵以及在500cm3的土壤中的蠕虫状生命阶段的数量。植物生长的温室平均温度为29℃。土壤湿度维持在最大持水量的40至60％之间。用SAS 9.1(SAS Institute Inc.)分析数据。分布假设用GLIMMIX程序的斯图登平板图评估。使用Dunnett’s选项评估未处理的对照之间的差异。[0079] 体外和温室结果[0080] 在第一次体外试验中，当将卵暴露于100％和50％的坚硬芽孢杆菌代谢物时，与水对照和培养基对照相比，肾形肾状线虫的卵孵化在48和72小时均减少(P≤0.01)(图1)。此外，在100％和50％的代谢物中在接种一小时内观测到了肾形肾状线虫二龄幼虫的麻痹，经过12小时全部二龄幼虫均被麻痹(P≤0.01)(图2)。在这些试验中没有观测到水和培养基对照之间的差异(P≤0.99)。
通过煤油的乳化、油滴的坍缩和血琼脂中形成的晕圈来确认生物表面活性剂的产
生(图3)。与BP培养基和水对照相比，在接种后的30分钟内，浓度为15×107cfu/ml的坚
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硬芽孢杆菌生物表面活性剂和活细胞麻痹了所有的二龄幼虫(P≤0.01)(图3)。在这两种对照之间没有差异(P≤0.99)。最后，在最后的体外试验中(其中在不同浓度下评估纯的坚硬芽孢杆菌生物表面活性剂)，在30分钟内2ppm和1ppm的生物表面活性剂分别麻痹了100％和45.9％的肾形肾状线虫的二龄幼虫(图4)。[0082] 与水对照相比，这两种浓度在麻痹二龄幼虫方面有所增加(P≤0.001)。0.5ppm、0.2ppm、0.1ppm和0.02ppm浓度的生物表面活性剂没有麻痹二龄幼虫并且与水对照没有不同(P≤0.932)。当在SEM下观测来自水对照和2ppm处理液的二龄幼虫时，没有观测到表皮的机械损伤(图5A，B)。在24小时内，坚硬芽孢杆菌GB-126的酶特性(profile)显示对用于分别在牛奶琼脂、淀粉琼脂和CMC琼脂中形成透明晕圈的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的高的酶活性。相反，在几丁质酶琼脂下没有观测到几丁质酶的产生。[0083] 在体外条件下，浓度为15×107cfu/ml的坚硬芽孢杆菌GB-126使用出自此细菌以及还有活细胞的次级代谢物抑制了肾形肾状线虫卵的孵化，并麻痹了二龄幼虫。在温室试验中，在种植的头30天内，以比例为7×106cfu/种子并作为种子处理液施用的坚硬芽孢杆菌GB-126减少了根中肾形肾状线虫雌虫和土壤中幼虫的数量。杀虫剂吡虫啉的效果——其用作种子处理液且用此细菌配制——没有显示任何杀线虫活性。
[0084] 结果证明坚硬芽孢杆菌GB-126对线虫的作用模式为次级代谢物对线虫有毒。在体外条件下，此次级代谢物为用于麻痹肾形肾状线虫幼虫并抑制卵孵化的生物表面活性剂。坚硬芽孢杆菌GB-126生物表面活性剂需要最低为1ppm的浓度以在30分钟内麻痹二龄幼虫。
[0085] 酶(淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶)的存在暗示坚硬芽孢杆菌GB-126可具有其他的针对在生命周期不同阶段的肾形肾状线虫以及其他线虫种类的作用模式。此细菌产生的蛋白酶可影响卵孵化并导致线虫麻痹。
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[0086] 诱导系统抗性的试验显示经坚硬芽孢杆菌GB-126(1×10cfu/ml)处理的棉花植株高于经线虫(P≤0.05)和粘质沙雷氏菌(1×109cfu/ml)处理的对照组(P≤0.01)。在这些处理中，在左根和右根的鲜重之间或在肾形肾状线虫雌虫和卵的数量之间没有差异(P≤0.99)(图6)。相比之下，在种植30天后，比例为7×106cfu/种子的坚硬芽孢杆菌GB-126减少了每克根中雌虫的数量(P≤0.001)和每500cm3土壤中幼虫的数量(P≤0.01)(图8)。在棉花植株生长或肾形肾状线虫生命阶段，杀虫剂吡虫啉没有任何效果。在所评估的浓度下，没有观测到棉花植株中坚硬芽孢杆菌GB-126诱导的系统抗性。[0087] 总之，在上述实验中在温室和田间条件下观测到的坚硬芽孢杆菌GB-126的生物防治活性(其中卵和幼虫阶段均减少)可得到解释，原因为该细菌产生了对植物寄生性线虫有毒的生物表面活性剂。在所测试的比例中未观测到ISR。然而，由于存在可对线虫有害的蛋白酶，坚硬芽孢杆菌GB-126可能具有针对肾形肾状线虫的其他作用机理。[0088] 1.Tian，B.，Yang，J.，Zhang，K.2007.Bacteria used in the biological control of plantparasitic nematodes:populations，mechanisms of action，and future prospects.FEMS Microbiol Ecol 61:197-213.
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