ChineseAgriculturalScienceBulletin
棉花accD基因植物表达载体的
构建与遗传转化的研究
张煜星1,2,3，崔燕3，祝建波3，周鹏2
（1海南大学农学院，海南儋州571737；
2中国热带农业科学院热带生物技术研究所国家重点实验室，海口571101；3
石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室，新疆石河子832003）
摘要：乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步，是脂肪酸合成的限速酶。采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase羧基转移酶β-CT亚基编码基因accD，ACCase羧基转移酶α-CT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列。将CAC3基因转运肽序列与accD基因进行体外重组，构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD。重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101。渗透法转化拟南芥，收种子，在含卡那霉素的MS培养基中发芽筛选。用叶盘法转化烟草，经不定芽诱导、生根培养，获转基因烟草植株。T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后，初步表明目的基因已在植株中转化成功，并可以正常转录。关键词：陆地棉；拟南芥；accD基因中图分类号：S336
文献标识码：A
论文编号：2009-0791
ConstructionofPlantExpressionVectoronaccDGenefomGossypuumhirsutum
(1CollegeZhangofYuxingandItsGeneticTransformation
1,2,3Agronomy,,HainanCuiYan3University,Zhu,Jianbo3Danzhou,ZhouHainanPeng2
571737;
2
NationalKeyBiotechnologyLaboratoryforTropicalCrops,InstituteofBioscienceandBiotechnology,CATAS,Haikou,571101;
3
LaboratoryofAgriculturalBiotechnology,CollegeofLifeScience,ShiheziUniversit,ShiheziXinjiang832003)
Abstract:GeneandThetransitacetyl-CoApeptideofcarboxylaseCAC3Gene(ACCase)wasamplifiedistherate-limitingfromGossypuumenzymehirsutumoffattyacidsGenomesynthesis.andArabidopsisTheaccDthalianaconstructed.TheGeneome.VectorPlantofExpressionpBI-CAC3tpVector-accDofwereFusiontransferredTransitintoPeptideAgrobacteriumofCAC3tumefaciensGeneandaccDGV3101.GeneUsingwasinfiltrationseedsofArabidopsisandleafdiscsthalianamethod,weretheselectedgenewereontransferredsolidmediumintocontainingArabidopsisKanamycin.thalianaandTransferredtobaccocell.leafsThetobaccowereselectedonsolidmediumcontainingKanamycin.TransgenicArabidopsisthaliana(T1)andofgenetobaccoplantswerefoundcontainingpurposegenebyPCR.AfterRT-PCR,itshowsthattheCAC3tp-accD
Keywords:couldtranscriptGossypuumnormally.
hirsutum,rabidopsisthaliana,accDGene
基金项目：863子项目“特殊生境植物资源的开发利用技术”（No：2007AA021401）转基因专项“转新型基因的棉花种质资源材料创造”（No：2008ZX08005-004）。
第一作者简介：张煜星，男，1967年出生，副教授，博士生，从事植物基因工程研究。通信地址：571101海口市城西学院路，中国热带农业科学院热带生物技术研究所国家重点实验室周鹏转张煜星，Tel：015109875070，E-mail：zyx2027193@163.com。通讯作者：男，1963年出生，研究员，博士生导师，从事植物基因工程研究。E-mail：Zhp6301@126.com。收稿日期：2009-04-16，修回日期：2009-05-07。
张煜星等：棉花accD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究·37·
0引言
验室保存。乙酰辅酶A羧化酶(acetylCoAcarboxyl-ase，1.2方法
ACCase)是脂肪酸生物合成的关键酶，是碳流进入脂1.2.1引物的设计根据NCBI公布的陆地棉ACCase肪酸生物合成的重要调控位点[1-4]。生物体中ACCase羧基转移酶β亚基基因(accD)的序列，设计了一对引物有2种类型，一种是异质型(heterom-eric)，另一类为同P1：5-ATCGATATGGAAATAGAGGCAAGAAAGC-3，质型(homomeric)。在构成异质型ACCase的4个亚基P2：5-GAGCTCACAAAGTCAAAGCCCATTACG中β-CT较为特殊，它由叶绿体基因组中的accD基因编C-3，在其上游引物5’引入ClaI位点，在其下游引物5’码。脂肪酸合成的前体是乙酰辅酶A，它首先在引入SacI位点。根据NCBI公布的拟南芥ACCase羧ACCase的作用下羧化形成丙二酰CoA。然后脂肪酸基转移酶α亚基基因(CAC3)的序列，设计一对扩增转运合成酶以丙二酰辅酶A为底物进行连续的聚合反应，肽（CAC3tp）引物P3:5-TCTAGAGAACTCAACGCAA以每次循环增加两个碳的频率合成酰基碳链，进一步AAAATGGC-3，P4:5-ATCGATTACATCAACAATCTT合成16~18碳的饱和脂肪酸。高等植物中饱和脂肪酸CTTCTCCAAT-3，在其上游引物5’引入XbaI位点，的合成在叶绿体基质中进行[5]。
在其下游引物5’引入ClaI位点。
鉴于ACCase在脂肪酸生物合成中的关键作用，1.2.2渗透法转化拟南芥将拟南芥的种子（T0）放于人们期望能通过超量表达ACCase基因提高油菜、大4℃春化3天，播种于花盆中，放于温室中，高湿度，强豆、芝麻和向日葵等油料作物的种子含油量。如光照8h，约经过2月，可进行转化试验，转化前浇水，Roesler等[6]将油菜种子贮藏蛋白napin特异表达启动使气孔打开，提高转化效率。活化农杆菌予与拟南芥同质型ACCase基因ACC1融合，在大豆pBI121-CAC3tp-accD至OD1.0左右，离心沉淀菌，去RubiscoSSU转移肽的转运下，成功实现了定向将胞质上清，用500ml含5%蔗糖加表面活性剂Silwet-77溶胶ACCase导入于油菜叶绿体，获得的转基因油菜100μl溶解菌体，即可进行转化试验。将开花的拟南T1代。Davis等[7]将噬菌体T7强启动子与大肠杆菌芥倒置于烧杯中，浸没10min，平放3min，等水干后，ACCase酶4个亚基编码基因连接(accB、accC、accD和用保鲜膜包裹，放于黑暗中16~24h，撕去保鲜膜。调accA依次排列)，构建成一个细菌多顺反子，用其转化整光照16h，1个月后收集种子（T1代）。将所收集的了大肠杆菌。
种子消毒后在无糖MS(含Kan50mg/L)培养基中发笔者根据NCBI公布的陆地棉ACCase羧基转移芽，进行筛选。培养基中加入Kan200mg/L继续进行酶β亚基基因序列采用PCR方法克隆了accD基因，使筛选，将生长良好的幼芽由培养基转移到蛭石中，调整该基因与拟南芥羧基转移酶α亚基编码基因CAC3中光照，1个月后可再次收集种子（T2代）。
定位于叶绿体的转运肽相连，构建植物表达载体
1.2.3叶盘法转化烟草将农杆菌接种至含抗生素LB
pBI-CAC3tp-accD，用CAC3基因转运肽介导的叶绿体固体平板上，28℃恒温培养24~48h；挑取一单菌落接间接转化方法转化拟南芥和烟草。为将来实现转基因种至含抗生素的LB液体培养基中，28℃恒温培养；取植物的脂肪酸含量的调控奠定了基础。200μl上述培养物，加入到20ml含抗生素的LB液体1材料与方法培养基中，28℃，250r/min振荡培养4~5h，至OD600=1.1材料
0.3~0.4；将此培养物离心，收集菌体，用MS液体培养1.1.1植物材料陆地棉（新陆早17号）由新疆农垦科基重悬菌体，即为转化用的侵染液。
学院棉花所惠增；
取无菌烟草小苗的叶片，剪成1cm2左右的小块哥伦比亚生态型拟南芥由北京大学蛋白质及植物（切掉叶边），将剪好的叶片放入农杆菌悬液中，放在基因工程实验室林忠平教授惠赠；
28℃摇床上轻摇10~15min，取出叶片，用滤纸吸干菌液，烟草(Nicotianatabacumvar.Winsconsin38)由石河铺在共培养培养基（MS+6-BA2mg/L+IAA0.3mg/L）子大学植物病毒研究室刘升学博士提供，无菌苗由石暗共培养2~3天后转移到筛选培养基上（MS+6-BA河子大学农业生物技术重点实验室培养；
2mg/L+IAA0.3mg/L+Kan50mg/L+Carb500mg/L）烟草NC89由石河子大学农业生物技术重点实验20天换一次培养基，大约2~3周可诱导出不定芽。待室提供；
不定芽长至1cm左右时，将其切下接到生根培养基1.1.2植物表达载体pBI121-CAC3tp-accD，构建方法（MS+IAA0.3mg/L+Kan50mg/L+Carb500mg/L）行参见张煜星等[8]，由石河子大学农业生物技术重点实
生根诱导，10天左右开始有根生成，待根系发达时，将
·38·中国农学通报http://www.casb.org.cn
根系生长良好的转化植株，转入土中，置温室培养。2结果及分析
1.2.4转基因拟南芥、烟草的检测按简易方法2.1植物表达载体pBI121-CAC3tp-accD的鉴定
(0.5mol/LNaOH，100mmol/LTris)提取转基因拟南芥提取pBI121-CAC3tp-accD质粒，分别用accD和
（T1代）和烟草的基因组DNA，以转基因拟南芥、烟草CAC3tp上下游引物进行PCR检测，分别得到1614bp
基因组DNA为模板，分别以相对应基因的上下游引和398bp的accD和CAC3转运肽目的片段（见图1，物进行PCR扩增，未转化的拟南芥和烟草植株基因组2）。将pBI121-CAC3tp-accD质粒用XbaI/SacI双酶切，DNA为模板的PCR扩增反应产物为阴性对照。PCR得到2012bp的CAC3tp-accD全长目的片段（见图3）。反应结束后，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增表明CAC3tp-accD基因已经构建到植物表达载体产物。对PCR结果为阳性的拟南芥和烟草植株用pBI121上。对插入片段进一步进行核苷酸序列分析，TRNZOL试剂提RNA，进行RT-PCR检测基因是否能结果表明，基因大小为2012bp，与设计相符，且阅读框够正常转录。
正确。
1
2
M
3
1
2
3
4
M
2000bp1614bp
1000750500bpbp
bp
20001000bpbp750bp398bp
500bp250bp100bp
图1pBI-CAC3tp-accD的accDPCR鉴定
图2pBI-CAC3tp-accD的CAC3tpPCR鉴定
注：LaneM：DNAMarkerDL2000；Lane1~2：pBI-CAC3tp-accD的注：LaneM：DNAMarkerDL2000；Lane2~4：pBI-CAC3tp-accD的accDPCR；Lane3：阴性对照。
CAC3tp-PCR；Lane1：阴性对照。
12M31234567M
2012bp
20001614bp
2000bp10001000bp
bp750bp750bp500bp500bp250bpbp250bp100bp
100bp
图3pBI-CAC3tp-accD的XbaI/SacI酶切鉴定
图4转CAC3tp-accD部分拟南芥PCR检测
注：LaneM：DNAMarkerDL2000；Lane1~2：pBI-CAC3tp-accD注：LaneM：DNAmarkerDL2000；Lane1~6：AmplificationofaccDXbaI/SacI；Lane3：theplasmidofpBI-CAC3tp-accD；Lane3：theplasmidfromtransgenicArabidopsisthaliana；Lane7：阴性对照。
ofpBI-CAC3tp-accD。
2.2转CAC3tp-accD基因拟南芥、烟草的PCR检测
TRNZOL试剂提RNA，进行RT-PCR检测基因是否能筛选的拟南芥和烟草都扩增出了目的片段1614bp够正常转录。基因的扩增结果与理论上也一致，说明（图4，5），与设计相符，PCR检测结果表明：初步筛选accD基因已经在拟南芥（图6）和转基因烟草（图7）中出转基因烟草植株和转基因拟南芥植株。表达。
2.3转基因拟南芥、烟草的RT-PCR检测
2.4转基因拟南芥、烟草的培养
对PCR结果为阳性的拟南芥和烟草植株用
收集转化后的拟南芥种子，在含Kan(50mg/L)的
张煜星等：棉花accD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究
·39·
1
2
3
M
4
12
34
5
6M
45001614bp20001000bp3000bp
bp1614bp
2000bp750bp1200bp500bp800bp500bpbp
250bp
图5转CAC3tp-accD部分烟草PCR检测
图6转pBI121-CAC3tp-accD拟南芥RT-PCR检测
注：LaneM：DNAmarker；Lane1~3：AmplificationofaccDfrom注：LaneM：DNAmarkerDL2000；Lane1~5：RT-PCRofaccDfromtransgenictobacco；Lane4：negativecontrol。
transgenicArabidopsisthaliana；Lane6：阴性对照。
1234M
Kan(50mg/L)生根培养基中生根培养，由于根部对抗生素较敏感，非转基因丛生芽在筛选培养基中较难生根，而转基因丛生芽在12天左右就可生根（如图
45002012bp
3000bp
9A）。炼苗后移栽到培养盘中可以正常生长（如图2000bp1200bp9B）。
800bp500bpbp
A
B
图7转pBI121-CAC3tp-accD烟草RT-PCR检测
注：LaneM：DNAmarkerIII；Lane1~3：AmplificationofCAC3tp-accDfromtransgenictobacco；Lane4：阴性对照。
AB
图9转基因烟草
3讨论
ACCase作为脂肪酸生物合成限速酶，在利用基因工程提高棉花等油料作物油脂含量研究中具有重要地位[9-12]。但迄今为止，这方面的研究进展并不很大，主要原因是异质型ACCase由4个亚基组成，这些亚基分别由3个核基因和1个叶绿体基因编码，采用基因工程使这些基因在目标生物中同时表达、定位于质体并组
图8转基因拟南芥
装成一种有活性的结构有很大的难度。而YukaMS培养基中进行筛选，筛选效果不是很明显，发芽的Madoka等[13]提出的质体中accD的表达可能制约质体拟南芥其叶片没有明显差别，继续在培养基中加入ACCase总体水平，为脂肪酸代谢调控中ACCase的研Kan(200mg/L)进行筛选，数日后挑选生长良好的幼苗究提供新方法。通过转运肽，利用细胞核转化方法将移栽至蛭石中，2~5天后用Kan(200mg/L)喷洒移栽出accD基因定位于叶绿体，以实现其成功表达，为转基的幼苗，非转基因幼苗变黄逐渐变白，无法继续生长。因棉花等油料作物脂肪酸代谢研究奠定了基础。
转基因幼苗在继续喷洒Kan(200mg/L)时无明显变化，构建植物表达载体时，将目的基因（陆地棉accD仍可继续正常生长（如图8A）。开花成熟后采收种子基因）和定位于叶绿体的转运肽编码序列（CAC3转运（如图8B）。转化后烟草叶片所生长的丛生芽在含
肽序列）相连，用细胞核转化技术把外源基因导入植物
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细胞。这样目的基因编码的蛋白质就有可在转运肽的[6]
RoeslerK,ShintaniD,SavageL,etal.TargetingoftheArabidopsis引导下输送到叶绿体颗粒中去，从而克服叶绿体DNAhomomericacetyl-coenzymeAcarboxylasetoplastidsofrapeseeds.多拷贝的问题，并且在很大程度上还可缓解转化体的PlantPhysiol,1997,113:75-81.分离[14]
。采用转运肽介导目的基因的叶绿体间接转化[7]
DavisMS,SolbiatiJ,CronanJEOverproductionofacetyl-CoAcarboxylaseactivityincreasestherateoffattyacidbiosynthesisin方法虽然没有整合到叶绿体基因组，但可以使目的基Escherichiacoli.JBiolChem,275(37):200028593-28598.因的产物蛋白定位到叶绿体。由于细胞核转基因技术[8]张煜星,崔燕,武寒雪,等.CAC3基因转运肽序列和accD基因融合已经相当成熟[15-18]，因此，这种间接的采用转运肽介导植物表达载体的构建[J].华北农学报2008,23(5):26-29.
叶绿体转化的方法也是一种较为便捷的途径。
[9]
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棉花被栽培以来，其被研究和利用的产品主要是纤维，讯,2004,40(3):385-390.
而具有极高经济价值的种子含油成分和含油量却一直[11]王永飞,马三梅,王莹.高等植物叶绿体基因组转化的应用[J].遗传,
未被重视。为此，为了提高棉农植棉副产品的收入，降2004,26(6):977-983.
低生产成本，提高棉花生产的效益，有必要对棉花种子[12]王幼平,曾宇,罗鹏.植物脂肪酸代谢工程研究进展[J].中国油料作
物学报,1998,20(4):88-92.
含油成分及含油量开展目标育种。
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笔者采用转运肽介导的叶绿体间接转化法，利用[J].植物学通报,2005,22(5):623-630.拟南芥CAC3基因转运肽将棉花accD基因输送到转化[14]
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