真菌多聚半乳糖醛酸酶的研究进展

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真菌多聚半乳糖醛酸酶的研究进展

董章勇1，2，王振中2

（1.仲恺农业工程学院园艺园林学院，广东广州510225；2.华南农业大学植物病理生理学研究室，广东广州510642）摘

要：真菌多聚半乳糖醛酸酶是植物细胞壁果胶的主要降解酶之一，是植物病原真菌的重要致病因子。综述了多聚半乳糖

醛酸酶的特性、多聚半乳糖醛酸酶基因及其特征、多聚半乳糖醛酸酶的分子进化、多聚半乳糖醛酸酶的表达调控及其在真菌致病过程中的作用。

关键词：真菌；细胞壁降解酶；果胶酶；多聚半乳糖醛酸酶中图分类号：S432.4+4

文献标识码：A

文章编号：1004-874X(2011)18-0125-03

果胶酶是参与果胶降解的一组复合细胞壁降解酶，能将高等植物的初生细胞壁和中胶层的果胶多聚物降解为片段，最初在产生软腐症状的植物组织中发现。主要包括多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase,PG）、果胶甲基半乳糖醛酸酶（Pectinmethylgalacturonicacidenzymes,PM

害的发生等。PG酶在真菌的致病过程中具有重要作用。

2真菌多聚半乳糖醛酸酶基因及其特征

G）、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（Poly-galacturonicacidtrans-eliminationenzyme,PGTE）、果胶甲基反式消除酶（Eliminationmethyltrans-eliminase,PMTE）和纤维素酶（Cellulase,Cx）等，其在病菌致病过程中起摄取营养和降解寄主组织的重要作用。

PG是首次从离体细胞壁中获得的由致病真菌产生的果胶酶，被认为是通过降解植物细胞壁中同源的多聚半乳糖醛酸区域起作用，从而引起组织浸解和原生质体死亡，与真菌的致病性和毒性相关[1-5]。多聚半乳糖醛酸酶的研究发展迅速，本文对多聚半乳糖醛酸酶及其序列特征、多聚半乳糖醛酸酶基因及其序列特征、多聚半乳糖醛酸酶的分子进化、多聚半乳糖醛酸酶的表达调控以及其与病原真菌的致病关系等进行综述。

1多聚半乳糖醛酸酶的特征与分类

多聚半乳糖醛酸酶是一种细胞壁结合蛋白，广泛存在

于细菌、真菌和植物中，具有水解酶的性质，是降解植物果胶骨架结构的主要酶之一[6]。根据其消除半乳糖醛酸的方式不同，多聚半乳糖醛酸酶分为内切多聚半乳糖醛酸酶

(EC3·2·1·15)(endo-PG或PG)和外切多聚半乳糖醛酸酶

···(EC32167)(exo-PG或EPG)两种。内切多聚半乳糖醛酸酶能随机地从多聚半乳糖醛酸链内部消解α-1,4-糖苷键，产生聚合度为10~14的寡聚半乳糖醛酸。外切多聚半乳糖醛酸酶能从寡聚半乳糖醛酸链的非还原末端消除单个半乳糖醛酸，产生聚合度逐步降低的寡聚半乳糖醛酸链和半乳糖醛酸单体[7]。endo-PG对底物的特异性较强，exo-PG则较弱。多聚半乳糖醛酸酶在植物中具有多种功能，如果实软化、器官脱落、花粉授粉、种子发育、胁迫反应及植物病

收稿日期：2011-07-30

基金项目：国家自然科学基金（30671349）；国家自然科学基金-广东联合基金（u0771001）；国家公益性行业（农业）科研专项（20090

目前已经鉴定了许多致病真菌的PG基因，其都不是单基因，而是以多基因的形式存在。如Botrytiscinerae[10]和Sclerotinasclerotiorum[9]的PG基因都是基因家族。真菌PG基因的开放读码框（ORF）绝大多数被内含子分隔，内含子最多的达7个。PG的前体蛋白N端信号肽一般为7～16AA，个别如曲霉菌的PGC有一个较长的N端信号肽（40AA）。N端的一段前序列只在PG的某一分化单位存在，这种前序列的功能至今不明，Della等[10]认为其可能以一种非活性状态在蛋白向最终定位运送过程中起作用，也有可能将蛋白定位在细胞壁的某一专门位置上。大多数真菌PG的分子量为20~60ku，等电点偏酸性。如黑曲霉(AspergillusnigerV.Tiegh)中有10个内切半乳糖醛酸酶，分子量大多为35~60ku，等电点为3.2~6.2[6]。

许多果胶酶都有糖基化位点。如串珠镰孢（Fusariummoniliforme）endo-PG前体有4个糖基化位点。不同真菌PG序列在总长上显示了相对高的差异，但仍有一些高度保守的区域存在，尤其是在酶的羧基端，该部分的一些高度保守的残基与催化功能有关。该特点对于利用体外进行蛋白表达及分离纯化具有重要的作用。对24种曲霉PG的酶的活性中心分析表明，一个外露的Tyr残基在pH为9.3~9.5时离子化，可能与催化有关；内藏的Tyr残基与催化关系密切，在pH为10.5时离子化。串珠镰孢endo-PG的His234对酶活性和浸解活性具有关键作用，与结合PGIP无关，当His23点突变成Lys时无酶活，Ser237和Ser240点突变成Gly时，酶活性分别降低48%和6%。通过序列比较还发现在所有报道的PG中，其都有一些稳定分子结构的二硫键，通过对这些半胱氨酸位置的分析反映了不同来源的PG在分类学上的位置。这些二硫键的存在保证了蛋白质三级结构的稳定性，并且通过折叠将活性的氨基酸残基暴露在蛋白质的表面[11]。

3真菌多聚半乳糖醛酸酶基因的表达调控

3049-05）

作者简介：董章勇（1981-），男，博士，讲师，E-mail：dongzhangyong

@hotmail.com

通讯作者：王振中（1956-），男，博士，教授，E-mail：zzwang@scau.

大多数真菌的PG都为分泌型胞外酶，且多为诱导酶，即有诱导物存在时菌株才能分泌多聚半乳糖醛酸酶[12]。Aspergillusglavus的PG基因可在含果胶的培养基上诱导表达，但不能被葡萄糖诱导。当Colletotrichumlindemuth-ianum侵入寄主后，PG的转录活性急速上升[13]，说明PG通过降解果胶物质，参与病菌穿透细胞壁。一些病原真菌只有在活体内才能检测到PG的活性，如SclerotiniaSclero-

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tiorum[12]。Botrytiscinerae产生的6种endo-PG同工酶受不同基因的调控，说明PG的组成性表达可能是一种PG降解果胶的产物诱导另一种endo-PG或exo-PG编码基因的表达[14]。同时，果胶酶的存在对后续产生的酶也起到了协同作用，陈捷等[15]通过对茎腐病玉米病株内超微结构的观察证实了这一点，可以说果胶酶是病原突破植物细胞壁过程中一类非常重要的酶。董章勇等[16]通过薄层等电聚焦同工酶电泳发现，香蕉枯萎病菌1号生理小种（FOC1）和4号生理小种（FOC4）分别在培养液中产生3和4种PG同工酶，但是只在被侵染的寄主体内产生2和3种同工酶，表明病原菌在植物体内外可产生不同的PG同工酶。真菌PG的表达还受其他因素的调控。美澳型核果链核盘菌〔Moniliniafructicola(Winter)Honey〕在含有Ca2+的培养基上，其PG酶活性均显著下降。说明Ca2+在真菌PG的调控中为负调控。

其功能，因此基因缺失将不会影响病菌的毒性。如对栗疫病的研究中观察到Cryphonectriaparasitica的endo-PG基因缺失，但突变株的毒性没有下降[24]，说明可能有其他PG基因存在，而且缺失突变株在培养基上的PG活性高于其在侵染寄主体内，可能是该PG基因与病菌毒性无关。

6多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白

在植物与病原物长期相互作用的过程中，植物相应地产生了一些能够抑制病原菌PG酶活性的因子，其中以多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（endo-Polygalacturonase-inhibitingprotein，简称PGIP）为主[25]。PGIP最早由Albersheim等[26]于1971年在菜豆下胚轴、番茄茎悬浮培养细胞的蛋白提取物中发现。PGIP是一类富含亮氨酸重复的细胞壁结合蛋白，能够特异性地、非竞争性地与PG酶结合，抑制PG酶的活性，增强植物的抗病性。1993年，Willamson等[27]首次从未成熟的树莓果实中分离出纯化的PGIP蛋白，该蛋白分子量约为38.5ku，其能够非竞争性地抑制灰霉属真菌的PG酶活性。1994年，Sharrock等[28]在西洋梨中发现了PGIP基因，其可以改变梨果实细胞壁降解产物的成分，使其中的果胶单体含量上升，从而有利于诱导植物的抗病性反应。

前人研究发现，PGIP可能更多地在植物生长的幼苗期对病原真菌起防御作用。阮期平等[29]分离纯化得到了小麦PGIP，进一步的免疫斑点试验表明小麦幼苗中PGIP的含量较高，且不易受到小麦禾谷镰刀菌的侵染。Favaron等[30]发现大豆下胚轴创伤能强烈诱导PGIP基因的表达。而在加入激发因子活性的寡聚半乳糖醛酸或真菌葡聚糖后悬浮培养的菜豆细胞中和经创伤或水杨酸处理以及感染病原真菌的菜豆下胚轴中PGIPmRNA有积累，说明在参与植物抗病的过程中，PGIP基因的表达可被激发因子、创伤和水杨酸诱导[29]调控，但对于PGIP基因的表达调控机制目前尚不清楚。

Bennett等[31]于1996年成功地将对真菌具有抑制作用的梨PGIP基因转入番茄并得到高效表达，使番茄对易感真菌（Botrytiscinerea）的抗性明显增加。1997年，Desiderio等[32]首次将大豆PGIP基因置于烟草花叶病毒启动子的诱导之下，构建了植物表达载体，并对番茄、烟草和大豆等进行了转化。用表达菜豆PGIP基因转化番茄，虽然未能增强其对葡萄孢（Botrytis）或链格孢（Alternaria）的抗性，但对镰刀菌（Fusarium）却具有抗性。说明将PGIP基因转入目标植物能够提高其本身的抗性。因此，若能证明香蕉体内存在PGIP蛋白，了解其在香蕉抗病反应中的作用并找出相对应的编码基因，将为香蕉抗病品种的培育和香蕉枯萎病的防治带来希望。

4真菌多聚半乳糖醛酸酶基因的分子进化

不同来源的PG基因的氨基酸序列差异很大，但仍有4个保守结构域存在。张弢等[17]以34个真菌的PG进行序列比对，结果表明真菌的PG序列之间表现出很高的相似性，相似性介于11.3%~100%之间。同一类型的PG之间相似性高，不同类型的PG之间相似性很低。真菌的PG酶存在11个完全保守的氨基酸残基，分别为Gly89、Gly105、Pro121、Pro142、Asp177、Asp180、Asn195、Ser222、Ser225、Val232和Tyr286。还有一些氨基酸位点虽然不完全保守，但都是相同性质不同残基之间的替换。细菌、真菌及植物的PG基因的系统进化树显示它们明显的聚为三大类。细菌PG位于树的基部，其次是真菌和植物PG。这很好的反映了它们的起源进化关系。

5真菌多聚半乳糖醛酸酶的致病性

自从致病真菌多聚半乳糖醛酸酶被发现能够降解植物细胞壁的主要成份半乳糖苷后，内切PG一直被密切关注。外切PG被认为同病原菌与植物的相互作用密切相关，因为其可能不受PGIP的抑制作用。F.oxsporum.f.sp.lycopersici的PG1[18]、PG2[18]和PG3[19]已被纯化。将PG1转化到PG1的缺失菌株F.oxysporumf.sp.melonis中[20]，但该转化菌株对甜瓜的毒力与野生菌株并无差异，说明PG1不是F.oxysporumf.sp.melonis的关键致病因子。王琪[21]研究表明PG酶是香蕉枯萎病4号小种致病的重要因子之一。

微生物可以产生多态型的酶，从而有利于充分利用不同条件下的各底物，研究表明病原真菌可在活体内外产生不同的果胶同工酶，而只有活体内产生的果胶酶才有致病作用。B.cinera在以果胶为碳源的培养基上产生了5种PG同工酶，在腐烂的苹果中只有1种。甜瓜果实腐烂病菌Phompsiscucubritae在果胶培养基上产生了15种PG同工酶，但在病组织中只有5种，其中1种可重现病害症状。F.solanisp.cucubitae在果胶培养基上产生了14种PG同工酶，只在病组织中检测到1种PG[22]。不同形式的PG可能来源于不同的基因或是受不同糖基化修饰的单个基因产物[23]，增加了基因鉴定的难度。此外，缺失的基因是侵染过程中未被活化的基因，或者果胶酶基因簇的其他基因能够弥补

7结语

采用分子遗传学方法对果胶酶基因进行研究仍存在较大困难。一方面，果胶酶可能被寄主体内的生理因子诱导或抑制，如果不能检测活体内果胶酶的活性，或者特异的果胶酶基因或基因数量未知，将很难鉴定缺失的单个果胶酶基因功能。随着近几年分子生物学和蛋白质组学的发展，真菌多聚半乳糖醛酸酶的研究得到了深入研究。但其具体机制及在致病过程中与寄主及本身之间的相互作用仍需进一步研究。

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