家畜产气荚膜梭菌病的诊断与防治

2019年7月第4期渊总第197期冤草食家畜渊双月刊冤家畜产气荚膜梭菌病的诊断与防治

渊1.新疆呼图壁种牛场有限公司袁新疆呼图壁县

朱波1袁张梅梅1袁祖新政1袁赵俊亮1*袁王登峰2831100曰

2.新疆畜牧科学院兽医研究所渊新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心冤袁乌鲁木齐830000冤

摘要院产气荚膜梭菌病是多种动物共患病袁被我国规定为二类动物疫病遥产气荚膜梭菌可引起牛羊猝死尧坏死性肠炎渊和羔羊痢疾等家畜常见传染病袁同时还可导致人气性坏疽和食物源性中毒袁给家畜养殖业带来严重的经济损失袁也严重威胁人类健康遥本文综述该病的实验室诊断和防治方法袁为基层临床兽医提供该病的预防和治疗参考资料遥

关键词院产气荚膜梭菌曰魏氏梭菌病曰实验室诊断曰疫病防治中图分类号院S855.1

文献标识码院粤

文章编号院员园园3原6猿7苑渊圆园19冤04原园园46-06

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)袁旧称魏氏梭菌袁是一种广泛分布于水源尧土壤等自然界以及动物肠道中的条件致病性细菌袁该菌环境耐受性强尧致病因子多种多样袁常导致人和多种家畜发生不同临床症状的疾病袁如院人气性坏疽尧食物中毒袁牛羊猝死综合症尧羊肠毒血症尧牛肠道出血综合症尧羔羊痢疾尧仔猪红痢尧禽坏死性肠炎等[1]遥由于产气荚膜梭菌的导致的疾病发病急尧病程短尧病死率高袁它的流行常给家价灭活疫苗袁为该病的有效防治做出了重要贡献遥但近年来袁即使在一些免疫畜群袁仍然出现产气荚膜梭畜养殖业造成严重的经济损失[2]遥自20世纪80年代以来袁国内一些研究单位成功研制了产气荚膜梭菌多菌的感染袁如何有效防控该病成为当前家畜养殖业可否健康发展的障碍之一遥有鉴于此袁本文综述了产气荚膜梭菌诊断和检测方法袁并从疫苗预防和抗生素治疗等方面进行防治技术方面总结袁为基层临床兽医提供该病的预防和治疗参考资料遥

1实验室诊断

败血症型产气荚膜梭菌感染的诊断相对简单袁根据死亡动物的临床症状尧剖检病理变化渊主要表现为败血症的临床症状和剖检病理变化冤和显微镜检查尧直接涂片的革兰氏染色和细菌培养可以做初步诊断袁其中袁产气荚膜梭菌在动物死亡后获得的病变或病理组织中被检出袁可以确定其可能是致病因素曰但大肠杆菌等其他细菌也可以引起动物败血症死亡袁动物死亡后袁产气荚膜梭菌可快速侵入袁此时检出该菌就不

资助项目院现代农业产业技术体系建设专项资金项目(CARS-36)

作者简介院朱波渊1986-冤袁男袁大专袁从事畜牧兽医工作遥E-mail院597742172@qq.com

通讯作者院赵俊亮(1979-)袁男袁本科袁畜牧师袁长期从事畜牧兽医工作遥E-mail院412743719@qq.com收稿日期院2019-05-27袁修回日期院2019-06-13

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2019年7月第4期渊总第197期冤能确定其为致病菌袁需要进行血清中和试验进行确诊遥1.1

病原学诊断

草食家畜渊双月刊冤细菌的分离培养和鉴定是进行细菌性传染病确诊的常用诊断方法遥根据感染疾病临床特征尧革兰氏

染色特性尧细菌形态和生化特性可以对该类细菌的感染做出初步诊断[3]遥产气荚膜梭菌常规生化鉴定通常野暴烈冶发酵反应等[4]遥此外袁基于气相-液相色谱对代谢产物短链脂肪酸的分析同样用于产气荚膜梭菌的

采用糖发酵试验尧七叶苷水解试验尧产吲哚试验尧硝酸盐还原试验尧明胶水解试验尧乳蛋白水解试验中的鉴定袁挥发性脂肪酸色谱分析显示袁产气荚膜梭菌产乙酸尧丙酸尧丁酸[5]袁部分菌株也可产琥珀酸和乳酸[6]袁

随着微生物及传染病研究的深入袁对微生物进行型尧亚型尧株乃至分子水平上的鉴定显得极为重要遥

但该方法尚不能进行亚型渊如毒素型冤区分袁且费时费力尧检测成本高等难以广泛应用于临床检测遥

分子生物学理论和技术在传染病检测与诊断中的广泛应用袁使得细菌鉴定更加准确尧快捷和经济节约遥当前袁用于产气荚膜梭病诊断的技术主要有聚合酶链式反应渊PCR冤技术尧16SrRNA序列测定和同源分析技术尧核酸探针技术等遥1.1.1PCR技术

依据产气荚膜梭菌琢毒素尧茁毒素尧着毒素和咨毒素的型特异基因发展而来的多重PCR方法广泛应

源菌株的鉴定袁如对粪便样本中肠毒性产气荚膜梭菌的鉴定等[9]遥由于该方法具有快捷尧简便尧易操作等优点袁已取代血清中和试验用于产气荚膜梭菌的毒素分型遥1.1.216SrRNA序列测定和同源分析技术

用于产气荚膜梭菌毒素型的鉴定[7,8]遥同时袁还可以根据生产和研究需要袁设计特异PCR引物用于特定来

鉴定遥根据GenBank公布的产气荚膜梭菌16SrRNA序列分析发现袁产气荚膜梭菌种间16SrRNA同源性达到了99.8%以上袁表现高度保守袁目前多对国际通用细菌16SrRNAPCR扩增引物可供选择袁测序测序并在NCBI网站BLAST搜索后袁与已知产气荚膜梭菌16SrRNA序列相似性为100%袁确定为产气失误造成的结果误判遥1.1.3

核酸探针技术

荚膜梭菌[11]遥与传统生化鉴定方法袁该方法较为快捷尧准确地给出试验结果袁减少了试验环节操作不当或通过获得16SrRNA序列可以快速准确地进行种的鉴定[10]遥Smith等人利用该方法扩增16SrRNA片段尧

16SrRNA是病原菌检测和鉴定的一种强有力工具袁可以实现对病原菌进行快速尧微量尧准确地分类

究曰我国杜蔷等人[13]建立了基于地高辛标记的肠毒素特异性基因原位杂交检测方法袁该方法不仅具有较1.1.4

高的敏感性和特异性袁同时还克服了32P标记探针的放射污染的问题遥

SDS-PAGE技术是利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应袁根据不同毒素型菌株所产生的主要毒素蛋白SDS-PAGE技术

VanDamme-Jongsten[12]等人报道了用32P标记探针检测食物中毒样品中的肠毒性产气荚膜梭菌的研

相对分子质量尧形状及其所带电荷量的差异实现对其梯度分开袁进而根据菌株含有的主要毒素进行毒素分型遥于晓霞等[14]建立了SDS-PAGE毒素分型方法袁并开展了临床分离株的分型调查袁其检测结果与多重异袁菌液上清毒素处理是确保检测结果可靠性的关键袁因此还有待更多试验数据予以验证遥1.1.5

基因芯片技术

PCR检测结果具有较高的一致性遥虽然该方法较为简单快捷袁但由于不同菌株分泌毒素能力存在一定差

基因芯片又称DNA微阵列(DNAmicroarray)袁是采用原位合成或直接点样的方法将DNA片段或寡核苷

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2019年7月第4期渊总第197期冤草食家畜渊双月刊冤酸片段排列在基片表面形成微矩阵袁待检样品用同位素或荧光分子标记后袁与微矩阵上探针通过DNA-DNA碱基配对杂交袁经过扫描及计算机分析即可获得样品中大量的基因序列及表达信息袁达到敏感尧高通量尧特异检测系统袁能够有效检测产气荚膜梭菌的毒素基因并能分型鉴定三种产气荚膜梭菌毒素遥1.2

血清学诊断

性地分析生物信息的目的[15]遥赵渝徽[16]利用该技术成功构建了压电石英晶体传感器产气荚膜梭菌基因芯片

产气荚膜梭菌感染的血清型诊断主要有血清中和试验尧酶联免疫吸附试验(ELISA)袁它们可应用于感

染菌株的血清型鉴定或所产毒素的定型袁也可用于感染菌株的血清抗体水平检测遥1.2.1血清中和试验

血清中和试验是评价产气荚膜梭菌毒素效价和毒素分型的经典方法袁广泛用于疫苗效果评价和菌株

分型鉴定遥该方法把产气荚膜梭菌培养上清毒素尧培养上清毒素与抗血清中和后混合物接种小鼠或豚鼠袁通过观察小鼠是否被保护袁豚鼠皮肤是否发生坏死等临床指标进行判定遥由于体外培养的着毒素尧咨毒素以原毒素形式存在于上清中袁需经胰蛋白酶等酶激活后才具有毒素活性曰并且袁毒素分型试验中需要多次中和试验才能判定结果袁导致该方法费时费力且耗费较高袁并不利于临床实际操作[17,18]遥当前袁广泛建立的1.2.2酶联免疫吸附试验

ELISA和PCR方法可解决上述不足遥

接ELISA渊IndirectELISA冤和竞争ELISA渊competitiveELISA冤方法用于评价着毒素抗血清效价袁两种

ELISA诊断方法具有快速尧简便尧特异尧敏感和高通量的检测特点袁澳大利亚Uzal等人[19]建立了间

ELISA方法与小鼠血清中和试验关联系数分别为0.99尧0.98袁结果基本一致遥McCourt等人[20]报告了夹心

EILSA渊SandwichELISA冤用于产气荚膜梭菌坏死性肠炎的诊断袁诊断结果也与商品化夹心ELISA诊断诊断的研究[21,22]袁也取得了较好结果遥但由于产气荚膜梭菌不同血清型菌株所产毒素种类复杂多样袁使得

试剂盒检测结果相同遥国内也有研究人员报道用间接ELISA和斑点ELISA渊dot-ELISA冤进行肠毒血症

产气荚膜梭菌病的ELISA诊断与检测在我国尚处在试验研究阶段遥

2防治

产气荚膜梭菌是肠道菌群的一部分袁外界环境的突然变化或其它应激破坏动物肠道菌群的稳态袁从

而导致梭菌的快速尧大量繁殖袁释放的毒素导致疾病的暴发遥该病发病急尧病程短且死率高袁故防治中以免疫预防为主曰同时袁减少抗生素的使用和应激防止动物肠道菌群的失衡在预防该病中也有积极作用遥此外袁维持肠道稳态尧克服外界刺激的益生菌等微生态制剂可能有一定的预防作用遥发病后袁及时发现并在发病早期使用抗生素治疗可能会降低损失遥2.1

目前袁灭活疫苗是预防产气荚膜梭菌性疾病的主要有效方法遥制苗菌株一般选择一定区域内优势毒免疫预防

素型菌株袁通过发酵生产外泌毒素袁经甲醛等方法灭活后加佐剂制备成类毒素疫苗遥国内常见的疫苗有以腐败梭菌和产气荚膜梭菌C型渊或B型冤尧D型菌种制备的预防羊快疫尧羊猝狙尧肠毒血症和羔羊痢疾的三联四防疫苗和经工艺改良的三联四防疫浓缩苗遥这类疫苗已经商业化生产并广泛应用绵羊梭菌病的防治遥除此之外袁我国王克领尧薛家宾等人分别研制出了兔出血症-魏氏梭菌病-巴氏杆菌病三联苗[23,24]曰赵立峰用本地分离的鹿源产气荚膜梭菌研制出鹿出血性肠炎疫苗[25]遥

在国外袁家畜产气荚膜梭菌病免疫也是牛羊免疫程序中的重要组成部分袁如用于预防牛羊肠毒血症

和梭菌性肠炎的UltrabacRCD疫苗袁为产气荚膜梭菌C型和D型菌苗-类毒素疫苗曰用于家畜多种梭菌病

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2019年7月第4期渊总第197期冤草食家畜渊双月刊冤梭菌疫苗袁和UltrabacR7/SomubacR疫苗袁为肖韦梭菌-腐败梭菌-诺维梭菌-污泥梭菌-C型和D型产气荚膜

免疫预防的UltrabacR8疫苗袁为肖韦梭菌-腐败梭菌-溶血梭菌-诺维梭菌-污泥梭菌-C型和D型产气荚膜

梭菌疫苗曰ScourguardR4KC为牛轮状病毒-冠状病毒灭活苗-C型产气荚膜梭菌-大肠杆菌菌苗-类毒素疫预防猪的大肠杆菌病和梭菌性肠毒血症遥2.2抗生素的治疗

苗袁用于预防健康和妊娠牛群腹泻病曰C型产气荚膜梭菌-大肠杆菌菌苗-类毒素疫苗渊ScourmuneR-C冤用于

虽然产气荚膜梭菌所引起的疫病发病急袁死亡快袁但在发病初期渊尚未大量产生毒素阶段冤袁采用敏感

抗生素进行治疗袁仍可取得一定的治疗效果遥根据产气荚膜梭菌的耐药基因检测尧序列分析和临床的应用袁临床分离株普遍对青霉素G尧头孢菌素尧四环素尧氯霉素尧盐霉素尧莫能菌素尧呋喃唑酮尧利福平尧杆菌肽尧卡巴多尧红霉素尧林可霉素尧克林霉素尧氨丙啉尧双呋脒腙和维吉尼亚霉素敏感袁但对黄霉素和氨基糖苷类抗生素有抵抗力[26,28]遥但也有报道称从猪和家禽分离的一些菌株对四环素尧杆菌肽尧维吉尼亚霉素尧大环内酯-林可酰胺类渊macrolide-lincosamide冤抗生素和其他用于促进生长和预防疾病的抗菌剂具有获得性耐肽和羧苄青霉素有抵抗力袁甚至有超过15%的分离株对青霉素有抵抗力[28]遥因此袁根据当地流行菌株耐药状况袁选择敏感类抗生素进行该病的早期治疗袁可能会降低产气荚膜梭菌病造成的损失遥

此外袁维护动物肠道菌群的稳态可减少梭菌病的发生遥益生菌在维持肠道稳态尧克服外界刺激尧抵御产气荚膜梭菌病感染中可发挥重要作用[27]遥Teo等人[29]等从健康鸡胃肠道筛选到一株新型枯草芽孢杆菌渊Bacillussubtilis冤袁该菌可分泌一种抗梭菌因子袁能够有效抑制产气荚膜梭菌在内的多种细菌的生长繁殖遥该项研究也为产气荚膜梭菌的生物防治提供了可能遥

药性[28]袁并有一项研究报道称来自家畜的大多数菌株对链霉素尧红霉素尧头孢菌素尧林可霉素尧四环素尧杆菌

3结语

产气荚膜梭菌的感染是近年来家畜养殖业中的流行较广尧死亡率较高的疫病之一遥虽然传统的类毒素疫苗在防治中发挥着重要作用袁但由于长期高密度的免疫袁由疫苗毒株所覆盖的产气荚膜梭菌毒素得到了较好的控制袁近年来袁由于毒力因子的水平转移及其新毒素的发现袁使得该菌引起或继发的感染有所加重遥此外袁产气荚膜梭菌作为一种条件性致病菌袁饲养方式尧饲草料结构以及气候条件的突然改变袁都提高了产气荚膜梭菌病流行的风险遥在当前形势下袁传统疫苗广泛代表性菌株的筛选尧新型高效疫苗的研制以及抗产气荚膜梭菌新型靶标药物的开发仍是未来防治该病的重要措施之一遥在采用疫苗尧药物进行防治的同时袁细化日常管理尧保持良好的饲养环境尧维持饲草料结构的平衡也是有效防控该病的主要措施遥只有通过营养尧日常管理尧合理药物使用与高效疫苗的研发等综合措施袁才能有效预防产气荚膜梭菌的感染尧降低该病的发病率袁从而有利于家畜养殖业的健康发展遥参考文献:

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DiagnosisandControlofClostridiumPerfringensinDomesticAnimals

ZHUBo1袁ZHANGMei-mei1袁ZHUXin-zheng1袁ZHAOJun-liang1*袁WANGDeng-feng22.InstituteofVeterinaryMedicine,XinjiangAcademyofAnimalSciences(XinjiangAcademyofAnimal

Sciences,AnimalClinicalResearchCenter),Urumqi830001,China冤

渊1.XinjiangHutubiBreedingCattleFarmCo.,Ltd.,HutubiXinjiang831100袁China曰

Abstract:TheClostridiumperfringensisacommondiseaseinmanyspeciesofanimalsandisdefinedinto

CategoryIIinChinawhichcancausesuddendeathsyndromeandintestinaltoxemiatocattleorsheepandresultinginseriouseconomiclossestolivestockbreedingindustry,andalsoseriousthreattohumanhealth.Inclinicalveterinarianstocontrolthedisease.

lambdysenteryandothercommondiseasesaswellasfoodpoisoningandtraumaticgasgangrenetohuman,thispaper,thelaboratorydiagnosisandcontrolmeasureswerediscussedtoprovidesomereferencesforKeywords:clostridiumperfringens曰clostridiosiswelchii曰laboratorydiagnosis曰diseasecontrol

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