(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105012321 A (43)申请公布日 2015.11.04
(21)申请号 201510514406.6(22)申请日 2015.08.20
(71)申请人中国人民解放军第三军医大学第三
附属医院
地址400042 重庆市渝中区大坪长江支路
10号(72)发明人易良 杨睿 欧阳庆 崔红娟
徐伦山 许民辉(74)专利代理机构北京同恒源知识产权代理有
限公司 11275
代理人赵荣之(51)Int.Cl.
A61K 31/65(2006.01)A61P 35/00(2006.01)
权利要求书1页 说明书7页 附图7页
(54)发明名称
替加环素在制备抗胶质瘤药物中的应用(57)摘要
本发明公开了替加环素在制备抗胶质瘤药物中的应用，不仅扩大了替加环素的应用范围，提高了其应用价值，给恶性胶质瘤的治疗带来了新的希望，还有助于进一步开发新的药物，比如以替加环素为先导化合物，通过结构修饰或改造，或有望进一步提高其活性或降低副作用。
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权 利 要 求 书
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1.替加环素在制备抗胶质瘤药物中的应用。
2.替加环素在制备抗脑星形胶质母细胞瘤药物中的应用。3.替加环素在制备抗神经胶质细胞瘤药物中的应用。4.替加环素在制备抑制胶质瘤细胞增殖的药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述胶质瘤细胞为GL261、U87、U251或U118细胞。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将胶质瘤细胞阻滞在G1期。
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说 明 书
替加环素在制备抗胶质瘤药物中的应用
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技术领域
[0001]
本发明属于医药领域，具体涉及替加环素在制备抗胶质瘤药物中的应用。
背景技术
胶质瘤是目前我国最常见的一种原发恶性脑肿瘤。根据国内50组综合统计资料表明，胶质瘤占颅内肿瘤的35.26％～60.96％，平均44.69％，且近年来发病率呈逐年增加的趋势。由于大多数胶质瘤呈浸润性生长及恶性变的特征，与周围脑组织边界不清，很难通过手术彻底清除。目前针对术后残留的胶质瘤细胞，主要采用放疗、化疗等措施来加以杀灭，然而这些术后残留病变对放疗、化疗等措施表现出显著地抵抗性，往往导致肿瘤复发，患者预后不佳。尽管近10年胶质瘤的综合治疗在手术、放疗、化疗、生物治疗等方面取得了一系列进展，但治疗效果仍无法令人满意，胶质瘤患者的平均生存期仍然较短，2年生存率不足30％，5年生存率不足5％。因此，仍旧需要新的有效治疗策略和治疗药物。[0003] 替加环素(Tigecycline),商品名泰格(Tygacil)，2005年由美国食品及药品管理局(FDA)批准上市的第一种甘氨环素类抗生素，其由米诺环素(一种半合成的四环素)衍生而来，化学名为：(4S,4aS,5aR,12aS)-9-(2-叔丁基氨基乙酰氨基)-4,7-双二甲氨基-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-2-并四苯甲酰胺。目前临床上替加环素是作为一种广谱抗生素使用，其与四环素类抗生素在结构、功能及作用机制上具有很大的相似性。另外，过去的研究表明，在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等一些前期临床的肿瘤模型中，一些四环素类抗生素如多西环素、米诺环素等具有一定的抗癌效果，但针对替加环素在胶质瘤上的抗癌效果仍然是未知的。
[0002]
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供替加环素在制备抗胶质瘤药物中的应用，扩大了替加环素的应用范围。本发明通过以下技术方案来实现所述目的：[0005] 1、替加环素在制备抗胶质瘤药物中的应用。[0006] 2、替加环素在制备抗脑星形胶质母细胞瘤药物中的应用。[0007] 3、替加环素在制备抗神经胶质细胞瘤药物中的应用。[0008] 4、替加环素在制备抑制胶质瘤细胞增殖的药物中的应用。[0009] 优选的，所述胶质瘤细胞为GL261、U87、U251或U118细胞。[0010] 优选的，将胶质瘤细胞阻滞在G1期。
[0011] 肿瘤细胞最主要的特征是持续不断地增殖，原因之一就是肿瘤细胞周期的不停滞性。细胞周期分为G1期(DNA合成前期)、S1期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、M期(分裂期)四个时期，并存在G1/S、S/G2、G2/M三个调控点，其中G1/S是细胞周期关键调控点，一旦调节此控点的基因过度表达将导致细胞增殖失控。本发明发现替加环素主要通过上调Mir-199b-5p从而抑制Hes1蛋白表达，进一步抑制AKT/ERK信号通路激活从而抑制cyclineD1/CDK4复合物的形成，使细胞停滞在G1期，导致细胞周期G1/S阻滞，进而起到对
[0004]
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说 明 书
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恶性胶质瘤的抵抗作用，该效应在胶质瘤动物模型实验中也进一步得到证实。[0012] 本发明的有益效果在于：本发明公开了替加环素在药物领域的新用途，不仅扩大了替加环素的应用范围，提高了其应用价值，给恶性胶质瘤的治疗带来了新的希望，还有助于进一步开发新的药物，比如以替加环素为先导化合物，通过结构修饰或改造，或有望进一步提高其活性或降低副作用。附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图，图中
GL261、U87、U251及U118为胶质瘤细胞系，而SVGP12为永生化的人正常星形胶质细胞系，Astrocyte则为原代培养的大鼠星形胶质细胞。[0014] 图1 CCK-8法检测细胞增殖实验结果；[0015] 图2 BrdU标记法检测细胞增殖实验结果；[0016] 图3软琼脂克隆形成实验的增殖实验结果；**表示与对照组(control)比较p＜0.01；
[0017] 图4流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期结果；A为流式细胞仪检测细胞凋亡结果；B为流式细胞仪检测细胞周期结果；
[0018] 图5免疫印迹检测凋亡和细胞周期相关蛋白；A为免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白结果；B为免疫印迹实验检测细胞周期相关蛋白结果；[0019] 图6 miRNA芯片结果；
[0020] 图7荧光定量PCR检测胶质瘤细胞系中miR-199b-5p表达结果，**表示与对照组(DMSO)比较p＜0.01；
[0021] 图8免疫印迹实验检测胶质瘤细胞系中Hes1和AKT/ERK信号通路蛋白表达结果；[0022] 图9皮下移植瘤体积和重量结果；A为皮下移植瘤体积增长曲线；B为皮下移植瘤重量；
[0023] 图10 Ki67检测皮下移植瘤中胶质瘤细胞增殖结果；
[0024] 图11荧光定量PCR检测皮下移植瘤组织中miR-199b-5p的表达，**表示与对照组(DMSO)比较p＜0.01；
[0025] 图12免疫印迹实验检测皮下移植瘤组织中蛋白表达结果。
[0013]
具体实施方式
[0026] 下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0027] 本发明受国家自然科学基金青年-面上连续资助项目(No.81270039)和中国博士后科学基金项目(No.2013M530388)资助。[0028] 实施例1 替加环素(Tigecycline，TIG)有效抑制胶质瘤细胞增殖[0029] 通过CCK-8法，BrdU标记法和软琼脂培养克隆形成实验检测胶质瘤细胞系U87和U118的增殖能力，了解替加环素对U87、U118增殖的影响。CCK-8法：将U87、U118细胞以密度为2×103个/孔接种于96孔细胞培养板，分为两组(实验组和对照组)，每组设置五个复孔。每孔加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培
[0030]
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说 明 书
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养基100μl，37℃培养12小时后，实验组加入终浓度为10uM的TIG，对照组加入用于配制TIG溶液的溶剂DMSO，之后各组分别于第0、24、48、72小时加入10μl的CCK-8溶液(Cell Counting Kit-8)，在37℃孵育4小时后用酶标仪测定在波长450nm处的吸光值(OD值)，绘制各组OD值随时间的变化曲线(即细胞生长曲线)如图1所示，以检测各组细胞的增殖能力，结果显示，TIG对胶质瘤细胞系U87、U118的增殖具有明显的抑制作用；在TIG分别对GL261细胞处理24、48、72小时的情况下，相比于对照组，10μM浓度的TIG能够明显地抑制胶质瘤细胞的增殖。[0031] BrdU标记法：将事先经过多聚赖氨酸包被的圆形玻片即爬片放入75％乙醇消毒，自然晾干之后放入24孔细胞培养板，并将U87、U118细胞以密度为2×104/ml接种于爬片上，分为两组(实验组和对照组)，每孔加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基100μl，37℃培养过夜。次日，实验组加入终浓度为10uM的TIG，对照组加入用于配制TIG溶液的溶剂DMSO。各组均于细胞给药处理之后48小时加入终浓度为30μg/L的BrdU，37℃孵育30分钟。取出后弃培养液，PBS洗涤3次(每次均5分钟，下同)，用4％多聚甲醛固定15分钟。固定完成弃去多聚甲醛，并用含0.3％Triton X-100的PBS洗涤3次，增加细胞膜通透性，然后加入10％山羊血清室温封闭30分钟。待封闭结束之后用PBS洗涤3次，加一抗即抗大鼠BrdU单抗(工作浓度1:100)，4℃孵育过夜，阴性对照为加入等量PBS。一抗孵育结束，PBS洗涤3次，加入二抗即Alexa Fluor 555标记山羊抗大鼠抗体(工作浓度1:500)，室温孵育2小时。二抗孵育结束，PBS洗涤3次，加入DAPI染液处理15分钟。染色结束后PBS洗涤3次，然后取出爬片，用抗荧光淬灭剂封于载玻片。在奥林巴斯激光共聚焦显微镜下随机计数这四组爬片中10个20倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，并统计每组的BrdU阳性率，结果见图2。如图2所示，同对照组相比，胶质瘤细胞经过10μM浓度的TIG处理48小时后，BrdU阳性率明显降低，表明10μM浓度的TIG能够明显地抑制胶质瘤细胞的增殖。
[0032] 软琼脂培养克隆形成试验：将对数生长期的U87和U118细胞消化成单细胞悬液并进行活细胞计数，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基将细胞稀释。分别配置1.2％和0.7％的两个浓度的低熔点琼脂糖并高温灭菌，60℃保存维持液态。下层胶：1.2％的液态琼脂糖和2×DMEM/F12培养基(含2×双抗和胎牛血清)按1：1混匀后加入6cm培养皿中。上层胶：待下层胶凝固后用0.7％的琼脂糖和2×DMEM/F12培养基(含2×双抗和胎牛血清)按1：1混匀，再加入100μl的细胞悬液混匀并加入到6cm培养皿中。实验组在软琼脂中加入终浓度为10uM的TIG，对照组加入等量DMSO。在37％下培养14天，0.1％结晶紫染色并计数克隆形成率，结果如图3所示，由图3可知，相比于对照组，10μM浓度的TIG能够明显地抑制胶质瘤细胞系U87和U118的克隆形成率。[0033] 实施例2 替加环素(Tigecycline，TIG)将胶质瘤细胞的细胞周期阻滞在G1期而不影响细胞凋亡
[0034] 通过流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡，了解替加环素对细胞周期和凋亡的影响；通过免疫印迹检测细胞周期蛋白和凋亡相关蛋白，了解替加环素对U87和U118细胞系G1期蛋白和凋亡相关蛋白表达影响。
[0035]
PI染色：将U87、U118细胞接种到100mm3培养皿上，分为两组(实验组和对照组)，
37℃培养过夜。次日，实验组加入终浓度为10μM的TIG，对照组加入用于配制TIG溶液的
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说 明 书
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溶剂DMSO。37℃培养48h后收集细胞，75％乙醇固定24小时，PI染色，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡，结果如图4所示，浓度为10μM的替加环素可以使胶质瘤细胞U87、U118阻滞在G1期，但对细胞凋亡影响微弱。[0036] 免疫印迹实验：将U87、U118细胞接种于6cm培养皿中，分为两组(实验组和对照组)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基在37℃下培养达到密度约60％，实验组加入终浓度为10μM的TIG，对照组加入用于配制TIG溶液的溶剂DMSO，之后各组分别于第12和24小时收集细胞总蛋白。配置10％的凝胶并按顺序上样，总上样量为40μg。80V恒压电泳至分离胶后转120V恒压电泳，电泳结束后以250mA恒流电转2小时。将PVDF膜用5％脱脂牛奶常温封闭4小时，按Marker进行剪膜处理，将含有相应蛋白的PVDF条带用一抗在4℃下孵育过夜(稀释比例按说明书进行)，一抗孵育结束用TBST洗膜三次。按照一抗种属选择对应二抗在常温下孵育3小时(稀释比例按说明书进行)，孵育结束用TBST洗膜三次并曝光。免疫印迹实验显示(图5)，替加环素能够显著抑制胶质瘤细胞系U87和U118中Cyclin D1和CDK4蛋白的表达，而对CDK6和凋亡相关的Caspase3影响微弱。[0037] 实施例3 替加环素(Tigecycline，TIG)上调miR-199-5p并抑制Hes1蛋白表达及AKT/ERK信号通路激活
[0038] 通过miRNA芯片和荧光定量PCR实验检测miRNA表达情况，了解替加环素对U87和U118细胞中miRNA表达的影响；通过免疫印迹实验检测HES1及AKT/ERK信号通路相关蛋白的表达量，了解替加环素对HES1蛋白表达及AKT/ERK信号通路激活的影响。[0039] miRNA芯片：将U87、U118细胞接种于6cm培养皿中，分为两组(实验组和对照组)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基在37℃下培养达到密度约60％，实验组加入终浓度为10μM的TIG，对照组加入用于配制TIG溶液的溶剂DMSO，之后各组于第24小时收集细胞总RNA。利用含有365个细胞周期相关miRNA的微阵列芯片对实验组和对照组的总RNA标本进行检测(ViiATM 7 Real-Time PCR System(ABI,USA))，结果见图6，miRNA芯片结果显示，替加环素显著影响10个miRNA的表达(其中5个上调，5个下调)，其显著上调miR-199b-5p的表达。[0040] 荧光定量PCR：将U87、U118细胞接种于6cm培养皿中，分为两组(实验组和对照组)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基在37℃下培养达到密度约60％，实验组加入终浓度为10μM的TIG，对照组加入用于配制TIG溶液的溶剂DMSO，之后各组分别于第12和24小时收集细胞总RNA。反转录体系如表1，反应条件为：42℃(10min)→30℃(20min)→99℃(5min)→4℃(5min)。[0041] 表1 反转录体系
[0042]
试剂
M-MLV Reverse TranscriptaseRNase inhibitor10×dNTP
体系(20ul)0.5μl0.5μl0.5μl
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RT primer5×Buffer
[0043]
RNA模板ddH2O
[0044]
说 明 书
1.0μl4.0μl
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2.0μg补水到20.0μl
荧光定量PCR体系如表2，反应条件为：94℃(5min)→[94℃(30s)→57℃(30s)→72℃(30s)]×35个循环→72℃(10min)。[0045] 表2 PCR体系
[0046]
试剂
2×miRcute miRNA PremixmiRNA Forward PrimermiRNA Reverse PrimercDNAddH2O
体系(20ul)10.0μl0.5μl0.5μl2.0μl补水到20.0μl
[0047]
荧光定量PCR实验结果见图7，结果显示，替加环素能够显著上调胶质瘤细胞系
U87和U118中miR-199b-5p的表达。[0048] 免疫印迹实验：将U87、U118细胞接种于6cm培养皿中，分为两组(实验组和对照组)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基在37℃下培养达到密度约60％，实验组加入终浓度为10μM的TIG，对照组加入用于配制TIG溶液的溶剂DMSO，之后各组分别于第12和24小时收集细胞总蛋白。配置10％的凝胶并按顺序上样，总上样量为40μg。80V恒压电泳至分离胶后转120V恒压电泳，电泳结束后以250mA恒流电转2小时。将PVDF膜用5％脱脂牛奶常温封闭4小时，按Marker进行剪膜处理，将含有相应蛋白的PVDF条带用一抗在4℃下孵育过夜(稀释比例按说明书进行)，一抗孵育结束用TBST洗膜三次。按照一抗种属选择对应二抗在常温下孵育3小时(稀释比例按说明书进行)，孵育结束用TBST洗膜三次并曝光。免疫印迹实验结果见图8。由图8可知，替加环素能够显著抑制胶质瘤细胞系U87和U118中HES1和p-AKT蛋白的表达，而上调p21蛋白的表达。[0049] 实施例4 替加环素(Tigecycline，TIG)显著抑制皮下胶质瘤模型的生长[0050] 通过小鼠皮下移植瘤模型构建并观察皮下移植瘤生长，了解替加环素对皮下胶质瘤生长的影响；通过Ki67标记实验检测Ki67阳性率，了解替加环素对皮下移植瘤组织中胶质瘤细胞增殖的影响；通过荧光定量PCR实验检测miR-199b-5p的表达，了解替加环素对皮下移植瘤组织中miR-199b-5p表达的影响；通过免疫印迹实验检测HES1和AKT/ERK信号通路相关蛋白的表达，了解替加环素对皮下移植瘤组织中HES1表达的影响及AKT/ERK信号通
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说 明 书
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路激活的影响。
[0051] 皮下移植瘤模型：选取4周龄(体重20±2g)的免疫缺陷鼠8只。将处于对数生长期的U87细胞系消化成单个细胞悬液并进行活细胞计数，用DMEM/F12培养基稀释，将细胞悬液接种如免疫缺陷鼠的臀部皮下，接种量为5×106个。接种完成后将免疫缺陷鼠随机分为两组，实验组和对照组，实验组接受替加环素腹腔注射(量)，对照组接受等量DMSO注射，分别于细胞接种后第4、8、12、16、20天用游标卡尺测量肿瘤体积V＝(6/π)×长径×短径2。于细胞接种后第20天剖取皮下移植瘤并拍照和称重，结果见图9。皮下移植瘤模拟显示，替加环素显著抑制皮下移植瘤生长。[0052] Ki67标记：将皮下移植瘤组织进行石蜡包埋，切片机切成5μm的组织片，依次进行脱蜡、复水和抗原修复。将修复好抗原的组织片用PBS漂洗2次并进行血清封闭，封闭好的组织放入Ki67一抗中4℃孵育过夜(1:100)。一抗孵育结束后用PBS漂洗3次，加入二抗常温孵育半小时，二抗孵育结束PBS漂洗3次，加入SABC孵育半小时后PBS漂洗3次，接着进行显色、苏木精复染、脱水和封片。镜下观察Ki67阳性率，结果见图10。Ki67标记显示，替加环素显著抑制皮下移植瘤组织中胶质瘤细胞增殖。[0053] 荧光定量PCR：提取皮下移植瘤组织的总RNA，反转录体系如表3，反应条件为：42℃(10min)→30℃(20min)→99℃(5min)→4℃(5min)。[0054] 表3 反转录体系
[0055]
试剂
M-MLV Reverse TranscriptaseRNase inhibitor10×dNTPRT primer5×BufferRNA模板ddH2O
[0056]
体系(20ul)0.5μl0.5μl0.5μl1.0μl4.0μl2.0μg补水到20.0μl
荧光定量PCR体系如表4，反应条件为：94℃(5min)→[94℃(30s)→57℃(30s)→7
2℃(30s)]×35个循环→72℃(10min)。[0057] 表4 PCR体系
[0058]
试剂
2×miRcute miRNA Premix
体系(20μl)10.0μl
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说 明 书
miRNA Forward PrimermiRNA Reverse PrimercDNAddH2O
0.5μl0.5μl2.0μl补水到20.0μl
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[0059]
荧光定量PCR实验结果见图11，替加环素能够显著皮下移植瘤组织中miR-199b-5p的表达。[0060] 免疫印迹实验：提取皮下移植瘤组织的总蛋白，配置10％的凝胶并按顺序上样，总上样量为40μg。80V恒压电泳至分离胶后转120V恒压电泳，电泳结束后以250mA恒流电转2小时。将PVDF膜用5％脱脂牛奶常温封闭4小时，按Marker进行剪膜处理，将含有相应蛋白的PVDF条带用一抗在4℃下孵育过夜(稀释比例按说明书进行)，一抗孵育结束用TBST洗膜三次。按照一抗种属选择对应二抗在常温下孵育3小时(稀释比例按说明书进行)，孵育结束用TBST洗膜三次并曝光。免疫印迹实验结果如图12所示，替加环素能够显著抑制皮下移植瘤组织中HES1、p-AKT、Cyclin D1和CDK6蛋白的表达，而上调p21蛋白的表达。
[0061] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
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说 明 书 附 图
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说 明 书 附 图
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图2
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图4
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图9
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