人源性Notch1胞内段真核表达载体的构建及鉴定

维普资讯 http://www.cqvip.com ・３２・　中华神经外科疾病研究杂志（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ　Ｄｉｓ　Ｒｅｓ）２００８：７（１　人及　文章编号：１６７１—２８９７（２００８）０７—０３２—０５　源鉴　・论著・　性Ｎｏｔｃｈ　１胞内段真核表达载体的构建　＇　疋　李斌　梁亮　甄海宁　林伟　晁晓东’　董文鹏　李娟　章翔ｈ（第四军医大学：　。西京脑科医院神经外科；　基础部医学遗传学与发育生物学教研室，陕西西安７１００３２）　摘要　目的构建人源性Ｎｏｔｃｈ　１胞内段（ＮＩＣＤ）真核表达载体ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ—ＮＩＣＤ，并观察其在　通过反转录一聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）从人脑胶质母细胞瘤细胞系Ｕ２５１　真核细胞中的表达。方法细胞中获得编码ＮＩＣＤ的ｃＤＮＡ，定向克隆至真核表达载体ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ；经酶切和测序鉴定正确后，　应用脂质体法转染ＨｅＬａ细胞，并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内ＮＩＣＤ的表达。结果　构建了真核　表达载体ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ—ＮＩＣＤ，将其转染Ｈｅｌａ细胞７２　ｈ后，蛋白免疫印迹法检测到细胞内ＮＩＣＤ的表　达显著增高。结论成功构建了真核表达载体ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ—ＮＩＣＤ，为研究Ｎｏｔｃｈ信号通路在人脑胶　质细胞瘤发生发展中的作用机制奠定了基础。　关键词Ｎｏｔｃｈ信号；胶质细胞瘤；真核表达　Ａ　中国图书资料分类号　Ｒ　７３９．４文献标识码Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆｈｕｍａｎ　Ｎｏｔｃｈ　１　ｉｎｔｒａｃｅＨｕｌａｒ　ｄｏｍａｉｎ　Ｂｉｎ’，ＬＩＡＮＧ　ｌ＿￣ｌｌｌｇ２，ＺＨＥＮ　Ｈａｉｎｉｎｇ’，２Ｎ　Ｗｅｉ’１，ＣＨＡＯ　Ｘｉａｏｄｏｎｇ’，ＤＯＮＧ　Ｗｅｎｐｅｎｇ’，１２　Ｊｕａｎ’，　ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｎｇ’　’Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ｘｉｊｉ，￣Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｅｅ；　Ｄｅｐａｒｔｅｎｍｔ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｅｖｅｌＤｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ￣ｔｎ　７１００３２，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｎｏｔｃｈ　１　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｌａｒｕ　ｄｏｍａｉｎ　（ＮＩＣＤ），ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ－ＮＩＣＤ，ａｎｄ　ｔｏ　ｅｘａｍｉｎｅ　ｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔ０ｔａｌ　ＲＮＡ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｕ２５１ＭＧ　ｃｅＨｓ　ａｎｄ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—ＰＣＲ）ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ｏｂｔｉｎ　ｔａｈｅ　ｃＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ＮＩＣＤ．ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｉｎｓｅｒｔｄ　ｉｎｔｅｏ　ｔｈｅ　ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ　ｖｅｃｔｏｒ　ｉｎ—ｆｒａｍｅ．Ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｅｗ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｉｒｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｎｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．｝ＩｅＬａ　ｃｅＨｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｄ　ｗｉｅｔｈ　ｔｈｅ　ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ－ＮＩＣＤ　ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ　ｖｅｃｔｏｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＮＩＣＤ　ｗａｓ　ｄｅｔｃｔｅｄ　ｂｙ　ｅＷｅｓｔｅｍ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ－ＮＩＣＤ　Ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｕｃｔｒｄ，ａｎｄ　ｓｉｅｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ＮＩＣＤ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｗａｓ　ｄｅｔｃｔｅｄ　ｉｅｎ　ｔｈｅ　ＨｅＬａ　ｃｅｌｌｓ　７２　ｈｏｕｒｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ－ＮＩＣＤ　ｉｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｌａｙ　ａ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｎｏｔｃｈ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｌｉｏ￣．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｎｏｔｃｈ　ｓｉｎａｌｉｇｎｇ；Ｇｌｉｏｍａ；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏｔｃｈ信号是一个在进化过程中高度保守的信　号通路，它通过相邻细胞问相互作用的方式精确地调　节着细胞的分化、增殖和凋亡，在生物体发育和肿瘤　发生发展过程中发挥着重要作用¨－５］。Ｎｏｔｃｈ信号与　基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０６７２３７１）　作者简介：李斌，硕士研究生，电话：（０２９）８４７７５３３０，Ｅ－ｍａｉｌ：　ｆｏｒａｎｇｅｌ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｎ　肿瘤的关系最早发现于急性Ｔ淋巴细胞白血病，染　色体易位ｔ（７；９）（ｑ３４；ｑ３４．３）使９号染色体上　Ｎｏｔｃｈ　１基因的胞内段编码区与７号染色体上Ｔ细胞　受体（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＣＲ）ｐ基因的增强子和启动子　区融合，导致Ｎｏｔｃｈ信号组成型激活，引起肿瘤的发　生　］。其后又有研究证实Ｎｏｔｃｈ胞内段具有引起细　胞恶性转化的能力＂　。　Ｎｏｔｃｈ信号在中枢神经系统肿瘤的研究相对较　通讯作者：章翔，教授、主任医师，电话：（０２９）８４７７５３２３，Ｅ—ｍａｉｌ：　ｘｚｈａｎｇ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　少，目前已证实Ｎｏｔｃｈ信号通路异常存在于髓母细胞　瘤¨ｏ一１２］、脑膜瘤　及胶质细胞瘤¨　引中。值得注　维普资讯 http://www.cqvip.com 中华神经外科疾病研究杂志（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ　Ｄｉｓ　Ｒｅｓ）２００８：７（１　意的是，究竟Ｎｏｔｃｈ信号是促进或抑制人脑胶质细胞　瘤的发生与发展，尚待进一步阐明。本研究旨在构建　人源性Ｎｏｔｃｈ　１胞内段真核表达载体，转染细胞后实　现细胞内Ｎｏｔｃｈ信号的组成型激活，为进一步探讨　Ｎｏｔｃｈ信号与人脑胶质细胞瘤生物学行为的关系奠　定研究基础。　材料与方法　一、材料　１．细胞株和菌种：Ｕ２５１细胞和ＨｅＬａ细胞源自　美国模式培养物收集中心（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｔｙｐｅ　ｃｕｈｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ），由本实验室保存。ＴＯＰ１０大肠杆　菌感受态细胞购自Ｔｉａｎｇｅｎ公司。　２．质粒：真核表达载体ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ质粒　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司）由本校基础部病理学教研室李烦繁　博士惠赠。　３．主要试剂：ＴＲＩＺＯＬ⑩试剂、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ　。。ＲＴ—　ＰＣＲ试剂盒、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　。Ｍ２００ｏ为美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　公司产品，ｐＧＥＭ￣－Ｔ　Ｅａｓｙ克隆试剂盒为Ｐｒｏｍｅｇａ公　司产品，ＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、限制性核酸内切酶　（Ｘｈｏ　Ｉ、ＢａｍＨ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉ）、Ｔ４　ＤＮＡ连接酶、蛋白质　Ｍａｒｋｅｒ为ＴａＫａＲａ公司产品，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒购　自Ｕ—ｇｅｎｅ公司，质粒小量提取试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公　司，羊抗人Ｎｏｔｃｈ　１多克隆抗体、兔抗人Ａｃｔｉｎ多克隆　抗体为美国Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司产品，辣根过氧化物酶标　记兔抗山羊、山羊抗兔ＩｇＧ为北京中杉金桥公司产　品，增强化学发光（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）试剂　盒购自美国Ｐｉｅｒｃｅ公司。引物合成和ＤＮＡ测序由　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司完成。　二、方法　人源性Ｎｏｔｃｈ　１胞内段ｃＤＮＡ的克隆：从人脑胶　质母细胞瘤细胞系Ｕ２５１细胞中提取总ＲＮＡ后，采　用ＲＴ—ＰＣＲ扩增获得编码Ｎｏｔｃｈ　１胞内段的ｃＤＮＡ，并　克隆入ｐＧＥＭ￣－Ｔ　Ｅａｓｙ载体，经酶切鉴定正确后送公　司测序，将测序正确的克隆命名为ｐＧＥＭ—Ｔ　Ｅａｓｙ—　ＮＩＣＤ。ＰＣＲ弓ｌ物：上游５＝ＣＴＣＧＡＧ　ｌＡＡＴＡＴＧＧｌ　ＴＧＣＴ　ＧＣＴＧＴＣＣＣＧＣＡＡＧ一３，（下划线部分为Ｘｈｏ　Ｉ限制性核　酸内切酶位点，框内部分为Ｋｏｚａｋ序列）；下游５：　ＧＧＡＴｃｃＧｃＡｃＡｃＡＧＡｃＧｃｃｃＧＡＡＧＧ一３，（下戈０线部分　为ＢａｍＨ　Ｉ限制性核酸内切酶位点）。ＰＣＲ反应条　件：９４ｃｃ预变性３　ｍｉｎ；９４￣Ｃ变性３０　Ｓ，６６ｃｃ退火３０　Ｓ，　７２ｃｃ延伸３　ｍｉｎ，反应３０个循环；７２￣Ｃ延伸５　ｍｉｎ。　ＰＣＲ产物长度２４８４ｂｐ。　２．真核表达载体ｐＩＲＥＳ２一ＥＧＦＰ—ＮＩＣＤ的构建：　将ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ载体用Ｘｈｏ　Ｉ和ＢａｍＨ　Ｉ进行双酶切　回收载体片段，将ｐＧＥＭ—Ｔ　Ｅａｓｙ—ＮＩＣＤ用Ｘｈｏ　Ｉ和　ＢａｍＨ　Ｉ进行双酶切回收目的基因片段。载体与目的　基因按摩尔比１：５连接过夜后转化ＴＯＰ１０大肠杆　菌感受态细胞并平铺于含有卡那霉素（３０　ｇ／ｍ１）的　ＬＢ培养基（Ｌｕｒｉａ—Ｂｅｎａｎｉ　ｍｅｄｉｕｍ，ＬＢ）平板上，随机　挑选阳性克隆扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定。　经酶切鉴定正确的克隆送公司测序。测序正确的克　隆命名为ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ—ＮＩＣＤ。　３．细胞转染：按照Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　。Ｍ２０００使用说　明书，于６孔板中每孔接种４×１０　个ＨｅＬａ细胞，孵　育２４　ｈ后细胞生长至７０％～８０％融合度即进行转　染。细胞转染实验分为３组：试验组转染ｐｌＲＥＳ２－＇　ＥＧＦＰ—ＮＩＣＤ质粒，对照组转染ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ质粒，同　时设立平行对照组；每组设立三个复孔。　４．蛋白免疫印迹检测ＮＩＣＤ表达：转染细胞７２　ｈ　后裂解细胞提取总蛋白，用ＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）　蛋白定量试剂盒定量后进行８％十二烷基硫酸钠一聚　丙烯酰胺凝胶电泳（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ—ｐｏｌｙａｃｒｙｌ—　ａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）分离蛋白，采用　湿转法将蛋白质转移至聚偏氟乙烯（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ　ｄｉｌｆｕｏｒｉｄｅ，ＰＶＤＦ）膜上，５％脱脂奶粉封闭后分别用稀　释的一抗［羊抗人Ｎｏｔｃｈ　１多克隆抗体（１：１００），兔　抗人Ａｃｔｉｎ多克隆抗体（１：５００）］及二抗［兔抗羊　ＩｇＧ（１：５　０００），羊抗兔ＩｇＧ（１：２　０００）］进行孵育，　最后采用增强化学发光法检测结果。　结　果　一、人源性Ｎｏｔｃｈ　１胞内段ｃＤＮＡ的克隆及鉴定　用ＲＴ—ＰＣＲ方法从Ｕ２５１细胞总ＲＮＡ中扩增编　码Ｎｏｔｃｈ　１胞内段的ｃＤＮＡ后进行１％的琼脂糖凝胶　电泳，结果显示在大约２　５００ｂｐ的位置可见特异性目　的条带（图１　Ａ），与预期结果完全一致。由于　ｐＧＥＭ￣－Ｔ　Ｅａｓｙ克隆载体的多克隆位点中有两个对称　的ＥｃｏＲ　Ｉ限制性核酸内切酶位点，而ＰＣＲ引物两端　又分别引入了Ｘｈｏ　Ｉ和ＢａｍＨ　Ｉ限制性核酸内切酶位　点，因此在ＰＣＲ产物克隆入ｐＧＥＭ￣－Ｔ　Ｅａｓｙ载体后，　分别用ＥｃｏＲ　Ｉ限制性核酸内切酶进行单酶切及Ｘｈｏ　Ｉ和ＢａｍＨ　Ｉ限制性核酸内切酶进行双酶切鉴定，１％　的琼脂糖凝胶电泳结果可见ｐＧＥＭ￣－Ｔ　Ｅａｓｙ载体条　带（３　Ｏ１５ｂｐ）和ＮＩＣＤ　ｃＤＮＡ条带（２　４８４ｂｐ），提示编　码Ｎｏｔｃｈ　１胞内段的ｃＤＮＡ已成功克隆入ｐＧＥＭ￣－Ｔ　Ｅａｓｙ载体（图１　Ｂ、Ｃ）。酶切鉴定正确的克隆送公司　测序，测序结果用ＤＮＡＭＡＮ软件（Ｖｅｒｓｉｏｎ　５．２．２）与　维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 经外科疾病研究杂志（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒ￣Ｄｉｓ　Ｒｅｓ）２００８：７（１　动物的多个物种之中。迄今为止在人类共发现了４　种Ｎｏｔｃｈ受体，即Ｎｏｔｃｈ　１／ＴＡＮ　１、Ｎｏｔｃｈ　２、Ｎｏｔｃｈ　３和　Ｎｏｔｃｈ　４／ｉｎｔ　３。　Ｎｏｔｃｈ　１受体属于Ｉ型膜蛋白，分子量约３００ｋＤ，　由细胞外亚基（Ｎｏｔｃｈ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｕｂｕｎｉｔ，Ｎ叭）和跨　膜亚基（Ｎｏｔｃｈ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ，Ｎ。。。Ｍ）组成，两　个亚基之间通过ｃａ¨依赖的非共价键结合在一起形　成异源二聚体。ＮＥｃ包括３６个串联排列的表皮生长　因子样重复序列和３个Ｌｉｎ－１２／Ｎｏｔｃｈ重复序列。其　中第１　１、１２个表皮生长因子样重复序列与Ｎｏｔｃｈ　１和　配体的相互结合有关，而Ｌｉｎ－１２／Ｎｏｔｃｈ重复序列则介　导了ＮＥｃ和ＮＴＭ之间ｃａ　依赖的相互作用。Ｎ　包括　跨膜区（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｇｉｏｎ）、重组信号结合蛋白．　ＪＫ相关序列（ＲＢＰ－ＪＫ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，　ＲＡＭ）、６个锚蛋白重复序列（Ａｎｋｙｒｉｎ　ｒｅｐｅａｔｓ）、２个　核定位序列（ｎｕｃｌｅａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、多聚谷氨　酰胺序列（ｐｌｏｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｓｔｒｅｔｃｈ）以及脯氨酸．谷氨酸．　丝氨酸．苏氨酸富集序列（ｐｒｏｌｉｎｅ．ｇｌｕｔａｍａｔｅ．ｓｅｒｉｎｅ．　ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＰＥＳＴ）　。其中ＲＡＭ序列和　锚蛋白重复序列是Ｎｏｔｃｈ　１受体与ＤＮＡ结合蛋白　ＣＢＦ－１（Ｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ－１），即重组信号结合　蛋白－ＪＫ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ－ＪＫ，ＲＢＰ－　ＪＫ）相结合的区域，而ＰＥＳＴ序列与Ｎｏｔｃｈ受体半衰期　的调节密切相关。　Ｎｏｔｃｈ　１受体最先以单链前体的形式合成，在高　尔基复合体内被ｆｕｒｉｎ样蛋白酶在其Ｓ．位点酶切为两　条多肽链，即Ｎ　和Ｎ　。配体与Ｎｏｔｃｈ　１受体结合后　促使ＮＥｃ与ＮＴＭ发生解离，同时激活后续的两次酶切　事件。首先，在Ｎ。　。细胞膜外侧靠近细胞膜处，由解　聚素金属蛋白酶（ａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ，　ＡＤＡＭ）家族的ＡＤＡＭ１０／Ｋｕｚ（Ｋｕｚｂａｎｉａｎ）或　ＡＤＡＭ１７／Ｊ］ｔ￣瘤坏死因子转化酶（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ．（ｉｔ　ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ，ＴＡＣＥ）对其ｓ２位点进行　酶切，产生Ｃ端的酶切产物ＮＥＸＴ（Ｎｏｔｃｈ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）。随后由＾ｙ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ在细胞膜内部靠近胞　浆侧的ｓ　位点，对ＮＥＸＴ进行酶切，从而释放了Ｎｏｔｃｈ　１受体真正的激活形式ＮＩＣＤ，转位人细胞核发生核　内应答。　目前，国内尚未见有人源性Ｎｏｔｃｈ　１胞内段真核　表达载体的报道，亦未见人源性Ｎｏｔｃｈ　１胞内段对人　脑胶质细胞瘤生物学行为影响的相关研究。本研究　从人脑胶质母细胞瘤细胞系Ｕ２５１细胞总ＲＮＡ中扩　增获得编码Ｎｏｔｃｈ　１胞内段的ｃＤＮＡ，将其克隆人基　于巨细胞病毒立即早期启动子（ｔｈｅ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏｆ　ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｕｒｓ，ＰｃＭｖ　ＩＥ）的ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ　载体，构建了人源性Ｎｏｔｃｈ　１胞内段真核表达载体　ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ－ＮＩＣＤ。ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ载体在多克隆位　点与增强型绿色荧光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）编码区之间设计有脑心肌炎病毒的内　核糖体结合位点（ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ，　ＩＲＥＳ），从而实现了ＮＩＣＤ和ＥＧＦＰ的共表达，为后续　实验中观察细胞转染效率，流式细胞仪分选或筛选稳　定转染的细胞克隆提供了便利条件。通过脂质体介　导的方法将ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ－ＮＩＣＤ载体转染ＨｅＬａ细胞　后，荧光显微镜可见转染细胞的胞浆和细胞核中均有　特异性绿色荧光蛋白的表达，蛋白免疫印迹证实转染　细胞内ＮＩＣＤ的表达明显增高。这为以后进一步研　究Ｎｏｔｃｈ信号与人脑胶质细胞瘤发生发展的关系奠　定了实验基础。　参考文献　Ｉ　Ｅｈｅｂａｕｅｒ　Ｍ，Ｈａｙｗ＇ａｒｄ　Ｐ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ—Ａｒｉｓａ　Ａ．Ｎｏｔｃｈ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　［Ｊ］．Ｓｃｉ　ＳＴＫＥ，２００６，２００６（３６４）：ｃｍ７．　２　Ｍｉｅｌｅ　Ｌ，Ｇｏｌｄｅ　Ｔ，Ｏｓｂｏｒｎｅ　Ｂ．Ｎｏｔｃｈ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃｕｒｔ　Ｍｏｌ　Ｍｅｄ，２００６，６（８）：９０５—９１８．　３　Ｍｉｅｌｅ　Ｌ．Ｎｏｔｃｈ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００６，１２（４）：１０７４　ｌ０７９．　４　Ｌｏｕｖｉ　Ａ，Ａｒｔａｖａｎｉｓ—Ｔｓａｋｏｎａｓ　Ｓ．Ｎｏｔｃｈ　ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ　ｉｎ　ｖｅ￣ｅｂｒａｔｅ　ｎｅｕｒａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００６，７（２）：９３—１０２．　５　Ａｒｔａｖａｎｉｓ－Ｔｓａｋｏｎａｓ　Ｓ，Ｒａｎｄ　ＭＤ，Ｌａｋｅ　ＲＪ．Ｎｏｔｃｈ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｃｅｌｌ　ｆａｔｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ｓｉｎｇａｌ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４　（５４１５）：７７０—７７６．　６　Ｅｌｌｉｓｅｎ　ＬＷ，Ｂｉｒｄ　Ｊ，Ｗｅｓｔ　ＤＣ，ｅｔ　ａ１．ＴＡＮ一１，ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｈｏｍｏｌｏｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｎｏｔｃｈ　ｇｅｎｅ，ｉｓ　ｂｒｏｋｅｎ　ｂｙ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｔｒａｎｓｌｃｏａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９１，６６（４）：６４９—６６１．　７　Ｃａｐｏｂｉａｎｃｏ　ＡＪ，Ｚａｇｏｕｒａｓ　Ｐ，Ｂｌａｕｍｕｅｌｌｅｒ　ＣＭ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅｏｐｌｓａｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ａｌｌｅｌｅｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＮＯＴＣＨＩ／ＴＡＮＩ　ａｎｄ　ＮＯＴＣＨ２［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，１９９７，１７（１１）：６２６５—６２７３．　８　Ｄｕｍｏｎｔ　Ｅ，Ｆｕｃｈｓ　ＫＰ，Ｂｏｍｍｅｒ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅｏｐｌｓａｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｎｏｔｃｈ　ｉｓ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｂｙ　ＲＢＰ－Ｊ　ｓｉｎｇａｌｌｉｎｇ　［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０００，１９（４）：５５６—５６１．　９　Ｊｅｆｆｒｉｅｓ　Ｓ，Ｃａｐｏｂｉａｎｃｏ　ＡＪ．Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｎｏｔｃｈ　ｒｅｑｕｉｒｅｓ　ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，２０００，２０（１１）：３９２８—３９４１．　１０　Ｆａｎ　Ｘ，Ｍｉｋｏｌａｅｎｋｏ　１，Ｅｌｈａｓｓａｎ　１，ｅｔ　ａ１．Ｎｏｔｃｈｌ　ａｎｄ　Ｎｏｔｃｈ２　ｈａｖｅ　ｏｐｐｏｓｉｔｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｅｍｂｒｙｏｎａｌ　ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，　２００４，６４（２１）：７７８７—７７９３．　１　１　Ｈａｌｌａｈａｎ　ＡＲ．Ｐｒｉｔｅｈａｒｄ　Ｊ１．Ｈａｎｓｃｎ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ＳｍｏＡｌ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｔｈａｔ　ｎｏｔｃｈ　ｓｉｎｇａｌｉｎｇ　ｉｓ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００４，６４　（２１）：７７９４—７８００．　１　２　Ｙｏｋｏｔａ　Ｎ，Ｍａｉｎｐｒｉｚｅ　ＴＧ，Ｔａｙｌｏｒ　ＭＤ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｕｓｉｎｇ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００４，２３（１９）：３４４４—３４５３．　１３　Ｃｕｅｖａｓ　１Ｃ，Ｓｌｃｏｕｍ　ＡＬ，Ｊｕｎ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｒｅｖｅａｌ　ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ　Ｎｏｔｃｈ　ｓｉｎｇａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００５，　６５（１２）：５０７０—５０７５．　维普资讯 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・３６・　中华神经外科疾病研究杂志（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ　Ｄｉｓ　Ｒｅｓ）２０ｏ８；７（１　Ｅｐｕｂ　２００７，Ｓｅｐ　１２．　１４　Ｐｕｒｏｗ　ＢＷ，Ｈａｑｕｅ　ＲＭ，Ｎｏｅｌ　ＭＷ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｏｔｃｈ一１　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｌｉｇａｎｄｓ，Ｄｅｌｔａ—ｌｉｋｅ一１　ａｎｄ　Ｊａｇｇｅｄ一１，ｉｓ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｆｏｒ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌ　１７　Ｋａｎａｍｏｒｉ　Ｍ，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ　Ｔ，Ｎｉｇｒｏ　ＪＭ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｔｉｂｕｔｒｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｏｔｃｈ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００５，６５（６）：２３５３—　２３６３．　１５　Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ　Ｋ，Ｒｅｄｄｙ　ＳＰ，Ｖｉｎｎａｋｏｔａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｕｐｒｅｇｎｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＳＣＬＩ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｏｔｃｈ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ　ｓｉｎａｇｌｉｎｇ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｍｕｈｉｏｆｒｍｅ［Ｊ］．　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，２００７，１０６（３）：４１７－４２７．　１８易海波，石松生，杨卫忠，等．Ｎｏｔｃｈ—ｌ基因在人脑胶质瘤中的表　达及其意义［Ｊ］．肿瘤防治研究，２００６，３３（１Ｏ）：７０１—７０３．　１９林伟，章翔，张塬，等．稳定整合靶向性ＭＳＰ５８基因ＲＮＡ干涉载　体的胶质瘤细胞系的建立［Ｊ］．中华神经外科疾病研究杂志，　２００７．６（４）：２９８—３０１．　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ　ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５，２４（４７）：７０７３—　７０８３．　１６　Ｚｈａｎｇ　ＸＰ，Ｚｈｅｎｇ　Ｇ，Ｚｏｕ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｎｏｔｃｈ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏ—　ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒｌ　ｓｔａｅｍ　ｃｅｌｌ—ｌｉｋｅ　ＣＯ１ｏｎｉｅｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００８，３０７（１—２）：１０１—１０８．　（收稿１３期：２００７—１０—１５；修回１３期：２００７—１１—１３）　２００６年度我国医疗机构国内和国际论文总数　摘自：西安交通大学医学中心网站　ｈｔｔｐ：／／ｙｘｚｘ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｓｋｙＮｅｗｓ／Ｉｎｄｅｘ／Ｃａｔａｌｏｇ４７／１００２．ａｓｐｘ