β地中海贫血基因突变检测和血液学特征分析

・４７５・１３地中海贫血基因突变检测和血液学特征分析周远青梁瑞莲梁玉全ｐ地贫是一种遗传性溶血性贫血病。本病危害极大，目前对ｐ地贫尚缺乏有效的治疗方法，应用基因诊断技术进行婚前指导或产前诊断，选择性淘汰重症患儿出生是首选的预防措施。本研究应用反向斑点杂交技术（ＲＤＢ）检测本院受检对象的ｐ地贫基因突变类型，并用ＳｙｓｍｅｘＸＥ２１００血液分析仪检测了ｐ地中海贫血患者的４个血液学指标，以了解地处Ｂ地贫高发地区的广东顺德人群的Ｂ地贫基因突变类型及其发生频率，为该地区开展遗传咨询、婚育指导和基因分析提供参考，以及为８地贫筛查和诊断提供血液学方面的实验室依据，现报告如下：一、资料与方法（一）资料：６８例８地贫病例为２００３年１月至２００４年１１月本院住院或门诊病例，均经本室基因分析确诊，年龄最小１５．血细胞分析：取受检者ＥＤＴＡ—Ｋ２抗凝血。采用日本ＸＥ２１００全自动血液分析仪进行血细胞分析获取各项血液学参数。Ｓｙｓｍｅｘ６．统计学处理：统计分析不同基因突变类型ｐ地贫的检测频率，并对不同基因突变类型的Ｂ地贫杂合子血液学特征删２．Ｏ统计软件包。二、结果与正常对照组血液学特征进行显著性￡检验。统计工具采用１．在本研究中，所有受检者中共检测出６８例Ｂ地贫患者，其中杂合子６４例、双重杂合子３例、纯合子１例。各种突变类型频率列于表１。表１６８例Ｂ地贫基因突变频率（％）天，最大７１岁。另有正常对照４０例，为健康体检者，并排除各类疾病后的自然人群，男女各２０例。（二）本室４个血液学特征正常参考值：ＭＣＶ８０～９０ｎ，ＭＣＨ２７－－３１ｐｇ，ＭＣＨＣ３２０－－３６０９／Ｌ，ＲＤＷ＜０．１４５。（三）方法１．１３地贫基因突变类型检测：ｐ地贫基因检测试剂盒由中山大学达安生物有限公司提供，ＰＣＲ扩增仪为美国的ＰＥ７７００型全自动实时荧光定量ＰＣＲ仪。２．ＤＮＡ提取：取２００Ｆａ抗凝血，经灭菌双蒸水三次洗涤去上清得到白色沉淀物，加入５０／ｄＤＮＡ提取液，１００＂（３煮沸１０分钟，１２０００ｒｐｍ离心５分钟，上清即可用于ＰＣＲ反应。３．ＰＣＲ反应：取试剂盒中ＰＣＲ反应管（ｍｉｘ—Ａ，ｍｉｘ—Ｂ）各一管加入提取好的标本２ｍ，由ＰＥ７７００型定量ＰＣＲ仪进行扩增，反应条件为９３１２３ｍｉｎ预变性后，置９３℃ｌｍｉｎ，５５℃２ｍｉｎ，７２℃ｌｍｉｎ３０ｓｅｃ共３５个循环，最后置７２℃保温５ｍｉｎ。扩增产物即可用于反向斑点杂交。２．不同基因突变类型的８地贫杂合子血液学特征（牙±５），见表２。三、讨论ｐ地贫是人类１１号常染色体隐性遗传病，高发于地中海沿岸的意大利、希腊、马耳他、塞浦路斯到东南弧各国的广大地区，在我国多发于长江以南的南方各省，包括广东、广西、福建、云南、四川、贵州等省。８珠蛋白基因具有高度的分子病理异质性，ｎｔｌｌｌａｓＳＫ等报道全世界已发现３００多种８珠蛋白４．反向斑点杂交：取已结合Ｂ地贫基因突变的等位基因特异性寡核苷酸（Ａ９０）探针的尼龙膜条浸入杂交液中，加入两管扩增产物并混匀，１００１２水浴变性后置４２℃杂交过夜，后经洗膜、显色后观察结果，膜条有蓝色杂交斑点为阳性结果。基因点突变，江悦华等报道中国已发现有２９种基因突变类型。本研究检测的６８例Ｂ地贫基因突变中，包含有６种突变类型，可见其多样性。表２不同基因突变类型的Ｂ地贫杂合子血液学特征比较＊表示与正常对照组同类项比较Ｐ＜０．００１作者单位：５２８３００，广东省佛山市顺德第一人民医院检验科・４７６・本文研究结果显示本地区人群中的Ｂ珠蛋白基因点突变以ＣＤ４１／４２、ＩＶＳ—ｎｔ６５４、ＣＤｌ７、ＴＡＴＡｎｔ一２８和ＣＤ７１／７２最和ＭＣＨ明显低于属于典型Ｂ＋地贫突变型的ＴＡＴＡｎｔ一２８，而另一种临床症状较重的ｐ＋地贫突变型ＩＶＳ—ｎｔ６５４的为常见，比例分别为４７．１％、２２．１％、１０．３％、１０．３％和３．０％，五种突变占本研究全部检测例数的９２．８％。周玉球等报道这五种突变广东的出现频率分别为４７．０％、２２．７％、１５．０％、８．９％和２．５％，全国的出现频率分别为４１．６％、２１．８％、１８．０％、８．０％和３．９％，三者结果显示，本地区（顺德地区）与ＭＣＶ和ＭＣＨ虽略低于ＣＤｌ７，但仍明显高于ＣＤ４１／４２、Ｃ１３７１／＇／２、ＣＤ２７／２８，这些结果与许洪平等报道的结果相一致。说明Ｐ地贫较ｐ＋地贫的ＭＣＶ和ＭＣＨ降低明显，红细胞的血液学参数改变的程度与口珠蛋白基因受损的程度密切相关，ｐ珠蛋白基因受损越严重，ＭＣＶ和ＭＣＨ值越低，因此，ＭＣＶ和ＭＣＨ降低可作为Ｂ地贫筛查的重要依据。另外，因ＭＣＶ只是反映红细胞平均体积，它不能代表红细胞体积大小的异质性，而ＲＤＷ则能较好地反映红细胞体积的异质性，ＲＤＷ可为Ｂ地贫的鉴别诊断提供参考。因为ｐ地贫分子基础及遗传方式都较明确，故把基因分析应用于临床，做好婚前、产前检查和遗传咨询，对于预防８地贫、避免重型ｐ地贫患儿出生有重要意义。然而Ｂ地贫的广东省、乃至全国的ｐ地贫基因突变类型和发生频率相比都非常接近，这与顺德地处口地贫高发省份广东的腹地有关。研究该地区ｐ地贫基因突变类型及发生频率，对该地区开展遗传咨询、婚育指导、基因分析和产前诊断具有重要意义。ｐ地贫的表型分两种，即产地贫和ｐ＋地贫，前者为ｐ链完全缺失，后者为ｐ链合成减少。本研究对６８例ｐ地贫的４项血液学特征分析结果表明，各型８地贫其ＭＣＶ和ＭＣＨ都较正常对照组明显降低，差异有非常显著性意义（Ｐ＜０．００１），完全符合小细胞低色素性贫ｍ的特征。并且，分析表２各种不同突变类型的ｐ地贫杂合子血液学特征发现，同属萨地贫突变型的ＣＤ４１／４２、ＣＤｌ７、ＣＤ７１／７２、ＣＤ２７／２８的ＭＣＶ基因分析费时且费用昂贵，因此在做ｐ地贫基因分析前做一些必要的筛查，可为病人省时和减轻经济负担。进行血细胞分析获取ＭＣＶ、ＭＣＨ和ＲＤＷ等血液学特征而作出初步判断是较为简便、经济和快捷的筛查手段。两例肾功能衰竭引起凝聚胺交叉配血不和张瑛田建波郎少磊潘滇豫谢爱敏王晓阳史玲玲薛燕Ａ型Ｒｈ（Ｄ）阳性，抗体筛选试验均未发现不规则在日常工作中，影响交叉配血因素很多，其中肝素钠是影响因素之一，笔者对肝素钠干扰凝聚胺（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）交叉配血患者２例进行分析处理，现报道如下。一、资料和方法１．病例报告例１女，４９岁，因患肾综合症出血热于２００３年１１月４例１抗体。含肝素血标本干扰凝聚胺交叉配血的处理方法是重新用凝聚胺交叉配血，主侧多加５滴应用液，离心后红细胞呈凝集，试验安全有效，结果相溶。例２日入院，１１月４日上午在血液透析室作肾脏透析时因贫血（血红蛋白６２．８ｇ／Ｌ）申请输血，采取血标本。例２女，６７岁，以浮肿、尿少、贫血门诊就诊，确诊为重Ｂ型Ｒｈ（Ｄ）阳性，抗体筛选试验未发现不规则抗体。含肝素钠血标本影响凝聚胺交叉配血的处理办法是将血球洗涤三次后重新配血，结果相溶。三、讨论日常工作中对受血者当前用药情况应引起重视，如体外循环、肝素药物治疗等均会给血型鉴定、交叉配血带来困难，本文两例均属血透析患者，上机１小时后采取血样，确认血标本使用了含肝素抗凝剂，两侧受血者采用洗涤红细胞，或多加凝聚胺应用液以中和肝素影响，达到主侧相溶，１例使用６单位悬红，２例使用４单位悬红均无输血不良反应。由于肝素带有高价负离子，可以中和凝聚胺应用液，增加红细胞表面负电荷电位，使红细胞之间非特异性反应减弱，故可对凝聚交叉配血造成干扰。所以，笔者认为：如果了解患者使用肝紊情况，可以直使用硫酸鱼精蛋白凝固血标本，或者操作时多加６滴应用液，也可将血球洗涤三次，以中和肝素作用，获得可靠结果。症肾功能衰竭，立即采取血液透析，透析１小时申请输血。上述例１患者血样在室温下用凝聚胺法交叉本血，主、次侧按标准加入凝聚胺应用液，离心后主侧无凝集发生，次侧凝集＋＋，遂进一步试验，将血球洗涤三次再配血，试剂有效，结果相溶。使用６单位红细胞悬液均元不良输血反应。上述例２患者血样在室温下配血主侧、次侧按标准加入凝聚胺应用液，离心后主侧不显凝集，试验无效，次侧呈凝集＋＋。遂迸一步试验，主侧加入凝聚胺应用液时多加５滴，离心后红细胞凝集＋十，试验有效，结果相溶，使用４单位红细胞悬液无不良输血反应。２．血型检查ＡＢＯ及Ｒｈ（Ｄ）试剂由南京华欣有限公司及（台资）珠海贝索生公司提供，交叉配血采用凝聚胺方法正规操作。二、结果作者单位：４７２０００，河南省三门峡市人民医院检验科β地中海贫血基因突变检测和血液学特征分析

作者：

作者单位：

周远青， 梁瑞莲， 梁玉全

528300,广东省佛山市顺德第一人民医院检验科

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