(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104447942 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.03.25
(21)申请号 201310416314.5(22)申请日 2013.09.12
(71)申请人深圳翰宇药业股份有限公司
地址518057 广东省深圳市南山区高新技术
工业园中区翰宇生物医药园办公大楼四层(72)发明人赵忠卫 刘建 马亚平 袁建成(74)专利代理机构深圳市深佳知识产权代理事
务所(普通合伙) 44285
代理人唐华明(51)Int.Cl.
C07K 1/14(2006.01)
权利要求书1页 说明书7页序列表1页 附图1页
(54)发明名称
一种含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法(57)摘要
本发明涉及多肽纯化领域，特别涉及一种含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法。该纯化方法包括：获得粗肽，经前处理，得到第一粗肽溶液，经第一调节pH值至6.0～8.0，得到第二粗肽溶液；取第二粗肽溶液与还原剂混合，经第二调节pH值至4.0～7.0，经过滤、纯化，即得；还原剂选自含有巯基的有机酸，含有硫离子或硫氢离子的酸或无机盐，含有还原性金属离子的无机盐，含有亚硫酸根或亚硫酸氢根的无机盐，或二氧化硫；易被氧化氨基酸为易发生氧化反应的氨基酸。本发明提供的纯化方法可有效去除含有易被氧化氨基酸的多肽中的颜色，提高了药品的质量，且提高了精肽的收率，操作简单，成本低，适于工业化生产。 C N 1 0 4 4 4 7 9 4 2 ACN 104447942 A
权 利 要 求 书
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1.一种含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：获得粗肽，经前处理，得到第一粗肽溶液，经第一调节pH值至6.0～8.0，得到第二粗肽溶液；
取所述第二粗肽溶液与还原剂混合，经第二调节pH值至4.0～7.0，经过滤、纯化，即得；
所述还原剂选自含有巯基的有机酸，含有硫离子或硫氢离子的酸或无机盐，含有还原性金属离子的无机盐，含有亚硫酸根或亚硫酸氢根的无机盐，或二氧化硫；
所述易被氧化氨基酸为易发生氧化反应的氨基酸。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述易被氧化氨基酸为色氨酸。3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述多肽为戈舍瑞林。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有巯基的有机酸为半胱氨酸或还原型谷胱甘肽。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有硫离子或硫氢离子的酸为氢硫酸。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有硫离子的无机盐为硫化钠。7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有硫氢离子的无机盐为硫氢化钠。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有还原性金属离子的无机盐为含亚铁离子的无机盐或含亚铜离子的无机盐。
9.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，所述含亚铁离子的无机盐为硫酸亚铁或氯化亚铁。
10.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，所述含亚铜离子的无机盐为硫酸亚铜或氯化亚铜。
11.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有亚硫酸根的无机盐为亚硫酸钠或亚硫酸钾。
12.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述含有亚硫酸氢根的无机盐为亚硫酸氢钠或亚硫酸氢钾。
13.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述还原剂与所述粗肽的质量比为（5～30）:100。
14.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述混合的时间为2～5min。
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说 明 书
一种含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法
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技术领域
[0001]
本发明涉及多肽纯化领域，特别涉及一种含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法。
背景技术
乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代
末开始一直呈上升趋势。乳腺癌中99%发生在女性，男性仅占1%。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率全国合计约为42.55/10万，城市约为51.91/10万，农村约为23.12/10万。目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。[0003] 常见的治疗乳腺癌的药物包括醋酸甲羟孕酮片、甲睾酮片、希罗达、倍美力、戈舍瑞林等。其中，戈舍瑞林是一种合成的十肽化合物，属于促黄体生成素释放激素的类似物，长期使用可抑制垂体的促黄体生成激素的分泌，从而引起女性血清雌二醇的下降，达到治疗乳腺癌的作用。
[0004] 戈舍瑞林肽序中具有色氨酸残基，色氨酸极易被氧化而产生非常明显的颜色，一般为红色或紫红色。采用固相合成法、液相合成法合成戈舍瑞林粗肽时，由于合成过程较为复杂，会用到多种缩合剂和催化剂，因此肽序中的色氨酸残基易被氧化而使产品带有红色或紫红色，影响戈舍瑞林药物的质量。其它的含有色氨酸等易被氧化氨基酸的多肽类药物在合成时也会发生不同程度的氧化而使产品带有颜色，因此在合成含有易被氧化氨基酸的多肽类药物过程中，需要去除颜色以保证药品的质量。一般采用采用HPLC纯化法和活性炭吸附法将氧化杂质去除。在利用HPLC纯化法去除颜色时，由于氧化并没有使整个肽序列发生变化，其性质与被氧化前差别很小，因此需要多次HPLC纯化才能将颜色去除，导致产品的收率较低；在利用活性炭吸附法去除颜色时，由于活性炭的吸附作用不具备选择性，在吸附颜色的同时，还会吸附目标产物，一旦吸附上目标产物就很难解离下来，导致目标产物的收率偏低，这种情况对于分子量在2000以下的多肽尤为明显。因此，提供一种既能有效去除多肽产品中的颜色，又能保证产品的收率较高的多肽纯化方法具有重要的现实意义。
[0002]
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法。该方法通过调整粗肽溶液的pH值至6.0～8.0，再加入还原剂，从而可去除粗肽溶液中的颜色，且提高了精肽的收率。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法，包括如下步骤：[0008] 获得粗肽，经前处理，得到第一粗肽溶液，经第一调节pH值至6.0～8.0，得到第二粗肽溶液；
[0005]
取第二粗肽溶液与还原剂混合，经第二调节pH值至4.0～7.0。
[0010] 还原剂选自含有巯基的有机酸，含有硫离子或硫氢离子的酸或无机盐，含有还原
[0009]
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说 明 书
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性金属离子的无机盐，含有亚硫酸根或亚硫酸氢根的无机盐，或二氧化硫；[0011] 易被氧化氨基酸为易发生氧化反应的氨基酸。[0012] 多肽作为药物，具有生理活性强、免疫原性低、疗效高等诸多优点，但多肽类物质自身固有的特点如口服利用率较低、酶降解性高以及半衰期极短等，使其作为药物的开发应用受到诸多的局限。而导致多肽药物不稳定的一个重要原因就是含有易被氧化氨基酸的多肽极易被氧化。含有易被氧化氨基酸的多肽在合成过程中被氧化后会致使多肽带有颜色，影响多肽产品的质量，因此需要去除被氧化的多肽。本发明提供了一种利用还原剂的还原性质去除被氧化的多肽的方法，并提供了还原剂的种类，还提供了被氧化的多肽与还原剂反应时适宜的pH值范围，本发明提供的纯化方法可避免多肽被过度的还原，不会破坏多肽的结构，保持了多肽原有的活性。为了避免多肽被过度的还原，多肽的结构不会被破坏，保持多肽原有的活性作用，作为优选，还原剂选自含有巯基的有机酸，含有硫离子或硫氢离子的酸或无机盐，含有还原性金属离子的无机盐，含有亚硫酸根或亚硫酸氢根的无机盐，或二氧化硫。
[0013] 不同种类的氨基酸稳定性有很大差别，有些氨基酸含有易被氧化的结构，在自然贮存条件下，容易发生氧化反应，这些易被氧化的氨基酸包括色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等。
[0014] 在本发明提供的一些实施例中，含易被氧化氨基酸的多肽为含有色氨酸的多肽，但含易被氧化氨基酸的多肽并不局限于含有色氨酸的多肽，只要是本领域技术人员认可的含易被氧化氨基酸的多肽均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。[0015] 在本发明提供的一些实施例中，含易被氧化氨基酸的多肽为戈舍瑞林。在本发明提供的一些实施例中，含有巯基的有机酸为半胱氨酸或还原型谷胱甘肽，但本领域技术人员认为可行的含有巯基的有机酸均在本发明的保护范围之内，含有巯基的有机酸种类并不局限于此，本发明在此不做限定。[0017] 在本发明提供的一些实施例中，含有硫离子或硫氢离子的酸为氢硫酸，但本领域技术人员认为可行的含有硫离子或硫氢离子的酸均在本发明的保护范围之内，含有硫离子或硫氢离子的酸种类并不局限于此，本发明在此不做限定。[0018] 在本发明提供的一些实施例中，含有硫离子的无机盐为硫化钠，但本领域技术人员认为可行的含有硫离子的无机盐均在本发明的保护范围之内，含有硫离子的无机盐种类并不局限于此，本发明在此不做限定。[0019] 在本发明提供的一些实施例中，含有硫氢离子的无机盐为硫氢化钠，但本领域技术人员认为可行的含有硫氢离子的无机盐均在本发明的保护范围之内，含有硫氢离子的无机盐种类并不局限于此，本发明在此不做限定。[0020] 在本发明提供的一些实施例中，含有还原性金属离子的无机盐为含亚铁离子的无机盐或含亚铜离子的无机盐，但本领域技术人员认为可行的含有还原性金属离子的无机盐
含有还原性金属离子的无机盐种类并不局限于此，本发明在均在本发明的保护范围之内，
此不做限定。
[0021] 在本发明提供的一些实施例中，含亚铁离子的无机盐为硫酸亚铁或氯化亚铁，但本领域技术人员认为可行的含亚铁离子的无机盐均在本发明的保护范围之内，含亚铁离子的无机盐种类并不局限于此，本发明在此不做限定。
[0016]
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说 明 书
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在本发明提供的一些实施例中，含亚铜离子的无机盐为硫酸亚铜或氯化亚铜，但
本领域技术人员认为可行的含亚铜离子的无机盐均在本发明的保护范围之内，含亚铜离子的无机盐种类并不局限于此，本发明在此不做限定。[0023] 在本发明提供的一些实施例中，含有亚硫酸根的无机盐为亚硫酸钠或亚硫酸钾，但本领域技术人员认为可行的含有亚硫酸根的无机盐均在本发明的保护范围之内，含有亚硫酸根的无机盐种类并不局限于此，本发明在此不做限定。[0024] 在本发明提供的一些实施例中，含有亚硫酸氢根的无机盐为亚硫酸氢钠或亚硫酸氢钾，但本领域技术人员认为可行的含有亚硫酸氢根的无机盐均在本发明的保护范围之内，含有亚硫酸氢根的无机盐种类并不局限于此，本发明在此不做限定。[0025] 为了保证被氧化的多肽充分去除，使多肽的颜色消失或变浅，提高多肽产品的质量，在本发明提供的一些实施例中，还原剂与粗肽的质量比为（5～30）:100。[0026] 作为优选，还原剂与粗肽的质量比为1:10。[0027] 在本发明提供的一些实施例中，还原剂需配制成还原剂溶液使用，作为优选，还原剂溶液的质量体积浓度为10g/L。
[0028] 为了保证还原剂与第二粗肽溶液混合均匀，使被氧化的多肽充分被还原，在本发明提供的一些实施例中，混合的时间为2～5min。[0029] 在本发明提供的一些实施例中，第一粗肽溶液的pH值小于6.0，为了保证还原剂能够很好的发挥还原作用，需要调节第一粗肽溶液的pH值至6.0～8.0，作为优选，第一调节pH值采用的试剂为碱溶液。[0030] 作为优选，第一调节pH值采用的碱溶液中的碱为易溶于水的碱。[0031] 在本发明提供的一些实施例中，第一调节pH值采用的碱溶液中的碱为氨水、氢氧化钠或氢氧化钾。但本领域技术人员认为可行的易溶于水的碱均在本发明的保护范围之内，易溶于水的碱的种类并不局限于此，本发明在此不做限定。[0032] 在本发明提供的一些实施例中，碱溶液的质量百分浓度为5%～40%。[0033] 在本发明提供的一些实施例中，纯化方法中的前处理为将粗肽溶解、稀释。[0034] 在本发明提供的一些实施例中，前处理中将粗肽溶解、稀释具体操作为：将醋酸、乙腈和水混合，获得混合溶剂；将粗肽溶解于混合溶剂中，再加入水进行稀释，得到第一粗肽溶液。
[0035] 在本发明提供的一些实施例中，将醋酸、乙腈和水混合后获得的混合溶剂中，醋酸、乙腈与水的体积比为（6～12）:（1～4）:（4～13）。
[0036] 在前处理中将粗肽溶解于混合溶剂后粗肽的质量体积浓度优选为20～50g/L。[0037] 在本发明提供的一些实施例中，将粗肽溶解于混合溶剂后粗肽的质量体积浓度为20～25g/L。
[0038] 在多肽的纯化方法中，粗肽经溶解、稀释后得到第一粗肽溶液，作为优选，第一粗肽溶液的质量体积浓度为2～45g/L。[0039] 在本发明提供的一些实施例中，第一粗肽溶液的质量体积浓度为5～14.3g/L。[0040] 在本发明提供的一些实施例中，过滤操作后的纯化具体采用HPLC系统纯化，流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为乙腈，按照B%为18%～38%、40min的梯度洗脱分段收集样品。
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在本发明提供的另一些实施例中，过滤操作后的纯化具体采用HPLC系统纯化，流
动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为乙腈，按照B%为25%～45%、40min的梯度洗脱分段收集样品。
[0042] 本发明提供了一种含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法，该纯化方法包括：获得粗肽，经前处理，得到第一粗肽溶液，经第一调节pH值至6.0～8.0，得到第二粗肽溶液；取第二粗肽溶液与还原剂混合，经第二调节pH值至4.0～7.0，经过滤、纯化，即得；还原剂选自含有巯基的有机酸，含有硫离子或硫氢离子的酸或无机盐，含有还原性金属离子的无机盐，含有亚硫酸根或亚硫酸氢根的无机盐，或二氧化硫；易被氧化氨基酸为易发生氧化反应的氨基酸。利用本发明提供的纯化方法可有效去除含有易被氧化氨基酸的多肽中的颜色，提高了药品的质量；利用本发明提供的方法获得的精肽收率可达90.9%，而利用活性炭吸附去除颜色的方法获得的精肽收率只有43.1%，利用HPLC纯化去除颜色的方法获得的精肽收率只有49.8%，表明本发明提供的纯化方法大大提高了精肽的收率。由此可见，本发明提供的纯化方法可有效去除含有易被氧化氨基酸的多肽中的颜色，提高了药品的质量，且提高了精肽的收率，操作简单，成本低，适于工业化生产。附图说明
[0043] 图1示实施例1提供的戈舍瑞林的质谱图。
具体实施方式
[0044] 本发明公开了一种含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0045] 本发明提供的含易被氧化氨基酸的多肽的纯化方法中所用试剂或原料均可由市场购得。
[0046] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：[0047] 实施例1戈舍瑞林粗肽的制备
[0048] 将10g替代度为0.7mmol/g的Sieber Resin，加入到固相反应柱中，加入DCM溶胀树脂30min后，用20%哌啶/DMF溶液两次去除Fmoc保护，时间分别为10min和15min。DMF洗涤六次，将12g N，N-二琥珀酰亚胺碳酸酯用20mL DMF溶解，加入0.51g DMAP冰水浴预活化5min，加入固相反应器中，室温反应2.5h。反应终点以茚三酮法检测为准。反应结束后DMF洗涤6次，加入25mL DMF作为溶剂，慢慢加入14.1mL水合肼，室温反应3h，反应结束后，DMF洗涤6次。将1.15g Fmoc-Pro-OH，4.86g HOAt在冰浴情况下溶于DMF中，加入上述树脂中反应平衡10min后，加入5.6mL DIC，室温反应2h。DMF洗涤3次后，DCM洗3次，用甲醇收缩3次，时间分别为3min、5min、8min，得到11.9g Fmoc-Pro-Azagly-Sieber Resin，检测替代度为0.495mmol/g。
[0050] 称取20.2g替代度为0.495mmol/g的Fmoc-Pro-Azagly-Sieber Resin（10mmol）
[0049]
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说 明 书
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加入反应器中，用DCM溶胀0.5h，再用20%哌啶/DMF两次去除Fmoc保护，时间分别为10min和15min。洗涤后连接Fmoc-Arg(NO2)-OH。将12.9g Fmoc-Arg(NO2)-OH，4.9g HOBt，6.1mL DIC溶于DCM中（可以加入少量DMF助溶），冰水浴活化5min后，加入固相反应器中，室温反应2h。反应终点以茚三酮法检测为准。按照上述连接Fmoc-Arg(NO2)-OH的方法依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Pyr-OH，得到序列如SEQ ID NO：1所示的肽树脂37.2g，其序列为Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-AzaGly-Sieber Resin。[0051] 配制裂解试剂380mL，其中三氟乙酸38mL，水19mL，DCM323mL，在-5℃的条件下预冷30min；将上述肽树脂37.2g加入到500mL圆底烧瓶中，将裂解试剂加入到上述圆底烧瓶中，搅拌的同时冰水浴，通入氮气。反应30min后撤走冰浴，室温下继续反应2h。过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。减压浓缩到60mL，将浓缩液缓慢加入600mL冰乙醚中沉淀，离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到序列如SEQ ID NO：1所示的粗肽16.2g，其序列为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2。[0052] 将上述粗肽16.2g溶到160mL4.4%甲酸甲醇溶液中，16.2g10%钯碳，室温反应0.5h，检测原料消失，滤掉钯碳，滤液检验浓缩至30mL，加入到500mL冰乙醚沉淀，离心，干燥，得到序列如SEQ ID NO：1所示的戈舍瑞林粗肽11.0g，颜色呈红色，粗肽收率86.7%，HPLC纯度93.7%，戈舍瑞林粗肽中戈舍瑞林精肽的含量为5.28g，由质谱确定结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2，其质谱数据为1269.7，质谱图见图1。
[0053] 实施例2戈舍瑞林精肽的制备
[0054] 按体积比6/1/13的比例配制醋酸、乙腈和水的混合溶剂500ml，取实施例1制得的戈舍瑞林粗肽10g溶解于200mL上述混合溶剂中，加入500mL水进行稀释，得到质量体积浓度为14.3g/L的戈舍瑞林第一粗肽溶液。滴加质量百分浓度为30%的氨水溶液，调节戈舍瑞林第一粗肽溶液的pH值至7.0，得到戈舍瑞林第二粗肽溶液。
[0055] 向上述戈舍瑞林第二粗肽溶液中加入200mL10g/L的亚硫酸钠溶液，搅拌4min，颜色由红色转为淡黄色。滴加醋酸调节pH值至6.0，过滤，将经过上述处理的戈舍瑞林第二粗肽溶液上HPLC系统纯化，流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为乙腈，按照B%为18%～38%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99%的戈舍瑞林精肽溶液，戈舍瑞林精肽溶液中戈舍瑞林精肽的含量为4.36g，收率为90.8%。[0056] 实施例3戈舍瑞林精肽的制备[0057] 按体积比4/1/5的比例配制醋酸、乙腈和水的混合溶剂500ml，取实施例1制得的戈舍瑞林粗肽10g溶解于400mL上述混合溶剂中，加入600mL水进行稀释，得到质量体积浓度为10g/L的戈舍瑞林第一粗肽溶液。滴加质量百分浓度为10%的氢氧化钠溶液，调节戈舍瑞林第一粗肽溶液的pH值至6.0，得到戈舍瑞林第二粗肽溶液。
[0058] 向上述戈舍瑞林第二粗肽溶液中加入50mL10g/L的半胱氨酸溶液，搅拌5min，颜色由红色转为淡黄色。滴加醋酸调节pH值至5.5，过滤，将经过上述处理的戈舍瑞林第二粗肽溶液上HPLC系统纯化，流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为乙腈，按照B%为25%～45%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99.1%的戈舍瑞林精肽溶液，戈舍瑞林精肽溶液中戈舍瑞林精肽的含量为4.22g，收率为87.9%。
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实施例4戈舍瑞林精肽的制备
[0060] 按体积比3/1/1的比例配制醋酸、乙腈和水的混合溶剂500ml，取实施例1制得的戈舍瑞林粗肽10g溶解于500mL上述混合溶剂中，加入1500mL水进行稀释，得到质量体积浓度为5g/L的戈舍瑞林第一粗肽溶液。滴加质量百分浓度为40%的氢氧化钾溶液，调节戈舍瑞林第一粗肽溶液的pH值至8.0，得到戈舍瑞林第二粗肽溶液。
[0061] 向上述戈舍瑞林第二粗肽溶液中加入300mL10g/L的硫化钠溶液，搅拌2min，颜色消失。滴加醋酸调节pH值至5.7，过滤，将经过上述处理的戈舍瑞林第二粗肽溶液上HPLC系统纯化，流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为乙腈，按照B%为18%～38%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99.3%的戈舍瑞林精肽溶液，戈舍瑞林精肽溶液中戈舍瑞林精肽的含量为4.31g，收率为90.1%。[0062] 实施例5戈舍瑞林精肽的制备[0063] 按体积比3/1/1的比例配制醋酸、乙腈和水的混合溶剂500ml，取实施例1制得的戈舍瑞林粗肽10g溶解于500mL上述混合溶剂中，加入1000mL水进行稀释，得到质量体积浓度为6.7g/L的戈舍瑞林第一粗肽溶液。滴加质量百分浓度为20%的氨水溶液，调节戈舍瑞林第一粗肽溶液的pH值至6.5，得到戈舍瑞林第二粗肽溶液。
[0064] 向上述戈舍瑞林第二粗肽溶液中加入100mL10g/L的氢硫酸，搅拌4.5min，颜色由红色转为淡黄色。滴加醋酸调节pH值至6.3，过滤，将经过上述处理的戈舍瑞林第二粗肽溶液上HPLC系统纯化，流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为乙腈，按照B%为25%～45%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99.2%的戈舍瑞林精肽溶液，戈舍瑞林精肽溶液中戈舍瑞林精肽的含量为4.26g，收率为90.5%。[0065] 实施例6戈舍瑞林精肽的制备[0066] 按体积比4/1/5的比例配制醋酸、乙腈和水的混合溶剂500ml，取实施例1制得的戈舍瑞林粗肽10g溶解于400mL上述混合溶剂中，加入600mL水进行稀释，得到质量体积浓度为10g/L的戈舍瑞林第一粗肽溶液。滴加质量百分浓度为5%的氢氧化钠溶液，调节戈舍瑞林第一粗肽溶液的pH值至7.5，得到戈舍瑞林第二粗肽溶液。
[0067] 向上述戈舍瑞林第二粗肽溶液中加入250mL10g/L的氯化亚铁溶液，搅拌2.5min，颜色由红色转为淡黄色。滴加醋酸调节pH值至5.3，过滤，将经过上述处理的戈舍瑞林第二粗肽溶液上HPLC系统纯化，流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为乙腈，按照B%为18%～38%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99.2%的戈舍瑞林精肽溶液，戈舍瑞林精肽溶液中戈舍瑞林精肽的含量为4.27g，收率为90.5%。[0068] 实施例7戈舍瑞林精肽的制备[0069] 按体积比4/1/5的比例配制醋酸、乙腈和水的混合溶剂500ml，取实施例1制得的戈舍瑞林粗肽10g溶解于400mL上述混合溶剂中，加入600mL水进行稀释，得到质量体积浓度为10g/L的戈舍瑞林第一粗肽溶液。滴加质量百分浓度为25%的氢氧化钾溶液，调节戈舍瑞林第一粗肽溶液的pH值至7.8，得到戈舍瑞林第二粗肽溶液。[0070] 向上述戈舍瑞林第二粗肽溶液中加入250mL10g/L的亚硫酸，搅拌2.5min，颜色消失。滴加醋酸调节pH值至4.0，过滤，将经过上述处理的戈舍瑞林第二粗肽溶液上HPLC系统纯化，流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为乙腈，按照B%为25%～45%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99.1%的戈舍瑞林精肽溶液，戈舍瑞林精肽溶
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液中戈舍瑞林精肽的含量为4.38g，收率为90.9%。[0071] 对比例1戈舍瑞林精肽的制备
[0072] 取实施例1制得的戈舍瑞林粗肽10g，利用活性炭吸附的方法对其进行纯化，具体操作为：按体积比4/1/5的比例配制醋酸、乙腈和水的混合溶剂500ml，将戈舍瑞林粗肽溶解于400mL上述混合溶剂中，加入600mL水进行稀释，得到质量体积浓度为10g/L的戈舍瑞林第一粗肽溶液。加入10g活性炭搅拌5h，过滤，取滤液上HPLC系统纯化，流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为乙腈，按照B%为25%～45%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，即得到纯度为99.1%的戈舍瑞林精肽溶液，戈舍瑞林精肽溶液中戈舍瑞林精肽的含量为2.07g，收率为43.1%。
[0073] 对比例2戈舍瑞林精肽的制备
[0074] 取实施例1制得的戈舍瑞林粗肽10g，利用HPLC纯化的方法对其进行纯化，具体操作为：按体积比4/1/5的比例配制醋酸、乙腈和水的混合溶剂500ml，将戈舍瑞林粗肽溶解于400mL上述混合溶剂中，加入600mL水进行稀释，得到质量体积浓度为10g/L的戈舍瑞林第一粗肽溶液。将戈舍瑞林第一粗肽溶液上HPLC系统纯化，流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为乙腈，按照B%为25%～45%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，纯度在99%以上的部分合并后加1.5倍体积的水稀释后得到第二溶液，将第二溶液再用此条件纯化一次得到第三溶液，将第三溶液用再进行HPLC系统纯化，流动相A为0.2%醋酸铵水溶液（氨水调pH值6.5），流动相B为乙腈，按照B%为26%～46%、40min的梯度洗脱分段收集样品，检测纯度，纯度在99%以上的部分合并后加1.5倍体积的水稀释后得到第四溶液，将第四溶液再用此条件纯化一次检测纯度，得到无任何颜色的溶液，即得到纯度为99.3%的戈舍瑞林精肽溶液，戈舍瑞林精肽溶液中戈舍瑞林精肽的含量为2.39g，收率为49.8%。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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图1
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