奶牛魏氏梭菌病病原的分离鉴定

中国动物检疫２０１１年第２８卷第８期　一６１一　奶牛魏氏梭菌病病原的分离鉴定　罗毅　（沈阳市动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳　１１００３４）　摘要：２０１０年１１月沈阳市一奶牛小区奶牛发生猝死，在病料中分离到１株有荚膜、芽孢的革兰氏阳性粗大杆菌，分离菌株　在绵羊血琼脂平板上培养后能形成溶血圈。根据发病奶牛临床症状、病理变化以及生化试验结果鉴定出该分离菌株为一株魏氏　梭菌；动物回归试验证实，该菌菌株可致小白鼠发病死亡，并从试验致死的小鼠病料中分离到了与死亡奶牛病料相一致的细菌。　从而确诊这起奶牛猝死是由魏氏梭茵感染所致。　关键词：魏氏梭茵；生化鉴定；动物实验　中图分类号：￥８５２．６１６　文献标识码：Ｂ　文章编号：１０ｏ５．９４４ｘ（２０１１）０８－００６１－－０２　魏氏梭菌是革兰氏阳性大杆菌，属条件性致病　菌，广泛分布于自然界，是肠道中的常在菌群之一。该　菌能产生多种外毒素和酶类，其中，外毒素是主要的　（ＭＥＴＴＬＥＲ－ＡＥ２４０，梅特勒一托利多上海仪器有限　公司）、水浴箱（ＳＡＬⅥＳ．ＩＣ２４０，瑞士）、离心机　（ＳＩＧＭＡ一３Ｋ３０，美国）。　致病因子【１］。动物一旦感染，死亡率可达７０％一１００％。　韩彗民等［２］认为能够造成家畜机体抵抗力下降的因　素均能导致魏氏梭菌大量增殖、产生毒素进而侵入血　循环系统并导致发病。柴同杰等　提出同样的观点，　１．２方法　１．２．１病原分离鉴定　１．２．１．１形态观察查。　无菌操作采取肠内容物、黏膜　刮下物、肝、脾做涂片革兰氏染色，然后进行显微镜检　即动物魏氏梭菌感染导致的猝死症，主要由肠毒血症　造成机体主要器官的衰竭所致。　２０１０年１　１月沈阳市一奶牛小区奶牛发生猝死，　死亡奶牛无任何前驱症状，突然发病死亡，以全身实　质脏器及消化道出血为特征，一周内全群发病死亡。　为查找病原，我们采集了有关病料进行了病原分离、　鉴定，并进行了动物回归试验。现将有关结果报告如　下。　１．２．１．２分离培养将肠内容物８０℃，水浴１５　ｍｉｎ，然后２　０００　ｒｐｍ离心１５　ｍｉｎ，取上清液，一份接　种麦康凯琼脂平皿培养，另一份接入厌氧肉肝汤，在　３７℃温箱中培养２０～２４　ｈ，然后在普通琼脂平板和绵　羊鲜血琼脂平板上划线，３７℃温箱进行分离培养。同　时将各脏器接种于肉肝汤，厌氧培养，再取培养物接　１材料和方法　种绵羊鲜血琼脂平皿培养，挑单个菌落进行纯培养同　时染色镜检。　１．２．１．３生化试验将分离菌纯培养物重新接种普　１．１　材料　１．１．１　病料来源于沈阳市苏家屯区一奶牛养殖小　区死亡的奶牛，病料主要包括死亡牛的心、肝、脾、肺、　通琼脂培养基，３７℃培养２０—２４　ｈ上卡，用ＶＩＴＥＫ－３２　进行检测。　１．２．２动物试验　肾、小肠等病变组织及肠内容物。　１．１．２主要试剂普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培　养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司：厌氧肉　肝汤培养基、绵羊鲜血琼脂平基均由本实验室自行配　１．２．２．１　肠毒素检查无菌操作取死牛病变明显的　肠内容物，用灭菌生理盐水进行１：ｌ稀释后，４℃，　３　０００　ｒｐｍ离心１０　ｍｉｎ，取上清液，再以４℃８　０００　ｒｐｍ离心１５　ｍｉｎ。然后取上清液腹腔注射１６－２０　ｇ小　白鼠５只，同时设立对照（注射灭菌生理盐水）２只，ｌ　制；ＶＩＴＥＫ—ＡＮＩ厌氧菌鉴定卡购自梅里埃公司；革兰　氏染色液购自杭州天和微生物试剂有限公司。　１．１．３试验动物实验用小白鼠购自沈阳医学院。　ｍＬ／只，７２ｈ内观察结果。　１．１．４主要仪器Ｖ１ＴＥＫ全自动微生物分析系统　（ｖＩＴＥＫ＿３２，法国梅里埃公司）、生物安全柜（ＮＵＡ．　ＩＲＥ　ＮＵ一４３０．６００Ｅ，美国ＮＵＡＩＲＥ公司）、高压蒸汽　灭菌器（ＴＯ　ＳＸ．７００，日本）、生化培养箱　（ＳＰｘ．１００Ｂ—Ｚ，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、　１．２．２．２分离菌毒力测定分离菌接种厌气肉肝汤　中，取２０ｈ的培养物腹腔注射小白鼠０．５　ｍＬ／只，注　射５只，观察结果。　２结果　２．１病原形态观察　生物显微镜（ＯＬⅥ　ｕｓ．ＣＸ３１，日本）、电子天平　病死动物的肝脏和肠管内容物革兰氏染色镜检　一６２一　中国动物检疫２０１１年第２８卷第８期　均见到一种革兰氏染色呈阳性，有荚膜的粗大杆菌，　单个或成双排列。有的有芽孢，位于菌体偏端。纯培养　的细菌形态为革兰氏阳性粗大杆菌，个别有芽孢。　２．２培养特性　加温处理后的肠内容物在麦康凯琼脂平皿上无　病，饲养条件突然改变，气候骤变或拥挤状态等原因　导致肠道细菌菌群紊乱，微生态平衡破坏，魏氏梭菌　趁机剧烈地繁殖，瞬间在肠道产生了大量的外毒素，　毒素粘附在肠粘膜上皮上，妨碍了氨基酸的吸收和运　输，这时肠壁的通透性升高，使得毒素进入血液循环，　引起肠毒血症，从而导致机体重要器官衰竭［３】。引起动　细菌生长，而接入厌氧肉肝汤试管１培养１８　ｈ后观　察，可见肉汤形成均匀的混悬液，液面上方靠近液体　侧试管壁上有２　ｃｍ长的石蜡附着。琼脂平板培养菌　落呈灰白色，表面光滑、湿润、圆盘型，有的有放射状　条文的大菌落，血琼脂板上有溶血环。　２．３生化实验　物死亡，此病的发生来势凶猛，传播快，发病急剧，死　亡迅速，往往来不及治疗全群死亡，因此预防是防止　该病发生的最好办法。平时应加强动物的饲养管理，　减少动物的应激反应。　参考文献：　［１】Ｌａｅｔｉｔｉａ　Ｐ，Ｍａｒｙｓｅ　Ｇ，Ｍｉｃｈｅｌ　Ｒ　Ｐ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒＭｎｇｅｎｓ：　ｔｏｘｉｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ【Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，７（３）：　１０４—１　１０．　经ＶＩＴＥＫ－３２进行检测，结果９９％为产气荚膜杆　菌。　２．４动物实验　２．４．１肠毒素检查结果肠内容物处理后注射５只　小白鼠，２４ｈ内全部死亡，而对照组小白鼠全部存活，　证明肠道内容物中有毒素存在。　［２】韩慧民，姚湘燕，孟锐奇．家畜猝死症病因学研究［Ｊ］．吉林　畜牧兽医，１９９６，１８（４）：２２—２４．　［３］柴同杰，马瑞华，常维山，等．产气荚膜梭状芽抱杆菌的流行　与致病机制［Ｊ］．中国预防兽医学报，２００１（Ｄ：７０．７２．　【４］Ｃｈａｉ　Ｔｏｎｇｊｉｅ．Ｖｏｒｋｏｍｍｅｎ　ｖｏｎ　Ｉｕｆｔｇｅｔｒａｇｅｎｅｎ　Ｋｅｉｍｅｎ　ｉｎ　Ｔｉｅｒｓｔａｅｌｌｅｎ　ａｎｄ　ｄｅｒ　Ｓｔａｌｌｕｍ　ｇｅｂｕｎｇ［Ｍ］．Ｇｅｒｍａｎｙ：Ｖｅｆｌａｇ　Ｓｈａｋｅｒ，　１　９９９：５５．５６．　２．４．２分离菌培养液的毒力测定肝片肉汤培养物　注射小白鼠，于７２ｈ内全部死亡。死后剖检见小鼠喉　头、气管环充血、出血；肺充血、气肿；心尖端心肌表面　有树枝状充血；肝脏出血；小肠肠壁松弛、肠粘膜变得　薄而透明、浆膜有出血斑、盲肠粘膜有出血斑点、内有　稀粪并有气泡；肝脏肿大、质地脆易碎、呈土黄色：脾　脏色深褐；肾脏淤血。　３讨论　［５］周浮伍，李华章．Ａ型魏氏梭菌所致家畜“猝死症”的诊断　与防制［Ｊ］．畜牧与兽医，１９９７，２９（３）：２６２．　［６】王明俊．兽医生物制品学［Ｍ］．北京：中国农业出版杜，１９９６：　５０４．　［７】张玉果．羊Ａ型魏氏梭菌病［Ｊ］．中国兽医杂志，１９９８，２４　（Ｉ）：２６．　近年来，我国魏氏梭菌感染动物致病的报道较　多　，因其死亡率高给养殖户带来较大经济损失。由　于魏氏梭菌病一般均是由细菌在肠道内产生毒素引　【８】记春华，王世洲，武兴周，等．初生仔猪Ａ型魏氏梭菌病诊　断与防冶［Ｊ］．中国兽医杂志，１９９２，１８（４）：４６．　【９】王海荣，唐德宏，鹿道新，等．畜舍环境中魏氏梭菌分离及基　因型鉴定［Ｊ］．中国人兽共患病杂志，２００５，２１（１１）：９８５—９８７．　起发病，细菌本身并不一定侵入机体，因此脏器内一　般难于分离到此菌，而肠道内菌群又较多，魏氏梭菌　又是肠道内的常在菌，故而分离较难，且即使是从肠　道分离出此菌也很难区分是否是致病菌，必须结合临　床症状和动物实验综合来诊断。　被引格式：　罗毅．奶牛魏氏梭菌病病原的分离鉴定【Ｊ］．中国动物检疫　２Ｏｌ１，２８（８）：６１－６２．　魏氏梭菌正常存在于人和动物肠逍内，并不致