显色培养基上沙门氏菌及干扰菌的分离鉴定
2022-10-01
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2017年6月 食品研究与开发 Food Research And Develooment 标准与检测 —===158 第38卷第12期 DOI:10.39690.issn.1005—6521.2017.12.034 显色培养基上沙门氏菌及干扰菌的分离鉴定 王萍,董贵军,乔勇升,张占林 (江苏泰州市食品药品检验所,江苏泰州225300) 摘要:研究比较沙门氏菌显色培养基(CAS)_L-T-&菌与沙门氏菌的区别,提高沙门氏茵的分离鉴定效率。使用沙门 氏菌和7株干扰菌(铜绿假单胞菌、恶臭假单胞茵、施氏假单胞茵、荧光假单胞菌、斯氏普罗威登斯菌、摩氏摩根菌摩 根亚种、粪产碱茵亚种)分别接种CAS、BS、XLD和HE培养基,观察菌落形态特征,分析生化试验结果,考察TI'B和 sc选择性增菌液对7株干扰菌的选择效果。7株干扰茵在CAS培养基上都是紫色菌落,仔细辨认大部分都可与沙门 氏茵区分,无法从菌落形态区分的恶臭假单胞茵和荧光假单胞茵通过在Bs上的生长情况或生化试验可以排除,1TrB 和sc选择性增茵液对7株干扰茵的选择效果各不相同,提示检测过程中1丫rB和SC两种增菌液须同时使用,相互补 充,提高检出率。 关键词:沙门氏茵;干扰茵;显色培养基;分离鉴定 Isolation and Identification of Salmonella and Interference Strains in Chromogenic Medium WANG Ping,DONG Gui-jun,QIAO Yong—sheng,ZHANG Zhan-lin (Jiangsu Taizhou Institute for Food and Drug Control,Taizhou 225300,Jiangsu,China) Abstract:To compare the differences between interference strains and Salmonella in Chromogenic agar Salmonella(CAS)and improve efifciency of isolating and identifying Salmonella.Salmonella and seven kinds of 作者简介:王萍(1983一),女(汉),工程师,硕士,研究方向:食品微生物检测。 lfammatory and sedative activities of the extracts and chemical con— 2004,20【4):168—171 stituents of Diospyros lotus L-【J】.Phytomedicine,2014,21(7):954- [15]王颖滢.荷叶生物碱单体的分离鉴定及其抑菌活性研究[D].杭 959 州:浙江大学,2012 [7]宗灿华,马山,于国萍.荷叶黄酮抗衰老作用研究[J].中国食物与 [16]蒋益虹.荷叶黄酮的乙醇提取工艺优化研究[J1.农业工程学报, 营养,2008(1 o1:52—53 2004,20f4):168-171 [8]范婷婷.荷叶生物碱类物质降脂减肥活性研究[D].杭州:浙江大 [17]陈凌,肖文军,傅冬和,等.荷叶中荷叶碱的高效液相色谱检测 学 2013 方法及其提取工艺研究『J].食品与机械,2012,28(4):8l一83,99 [9】You J S,Lee Y J,Kim K S,et a1.Ethanol extract of lotus(Nelumbo [18]肖娟,孙智达,谢笔钧,等.荷叶生物碱提取工艺响应曲面优化 nucifera)root exhibits an anti—adipogenic effect in human pre— 研究叨.食品科学,2009(22):157—161 adipocytes and anti—obesity and anti-oxidant effects in rats fed a [19】何晓曦,孔令提,张泽生,等.不同产地和不同采收期荷叶中生 high—fat diet[J].Nutirtion Research,2014,34(3):258—267 物碱的含量变化I J1.天然产物研究与开发,2013,25(5):652—655, [1O]蒋益虹.荷叶抑菌活性成分的研究【D].杭州:浙江大学,2007 66l [1 1]Naili M B,Alghazeer R O,Saleh N A,et a1.Evaluation of antibacte— [2O]林木仙,林国荣,陈剑锋,等.高纯度荷叶碱的制备及其药效研 rial and antioxidant activities of Artemisia campestris(Astraceae) 究[J】_福州大学学报(自然科学版),2008,36(2):303—307,3 1 2 and Ziziphus lotus(Rhamnacea)[J].Arabian Journal of Chemistry, [21】高梦祥,郭珊珊.机械化学法提取荷叶总黄酮的工艺研究[J].湖 2010,3(2):79—84 北农业科学,2013,52(23):5825—5828 【l2]金德宽,孙芝杨.荷叶黄酮的复合法提取及清除自由基的研究 [22]王玲玲,刘斌,石任兵.荷叶的化学成分研究【J】.天然产物研究与 [J1.食品研究与开发,2011,32(12):16—20 开发,2009,21(3):416—419 [13]曾虹燕,苏杰龙,方芳,等.不同方法提取的荷叶挥发油化学成 【23]赵小亮,王智民,马小军,等.荷叶化学成分研究[J】_中国中药杂 分分析[JJ_西北植物学报,2005,25(3):578—582 志,2013。38(5):703—708 [14】蒋益虹.荷叶黄酮的乙醇提取工艺优化研究[J1_农业工程学报, 收稿日期:2016—09—26 标准与检测 王萍,等:显色培养基上沙门氏菌及干扰茵的分离鉴定 interfering bacteria(Pseudomonas aeruginosa,Pseudomonas putida,Pseudomonas stutzeri,Pseudomonasfluo— rescerl¥,Provideneia stuartii,Morganella morganii ssp morganii,Alcaligenesfaecalis sspfaecalis)were inocu一 1ated in isolation medium(CAS,BS,XLD and HE)to observe the characteristics of the colony form,analyzed biochemical test results,investigated the selective effect of TFB and SC Broth on seven kinds of interfering bac— teria.Seven kinds of interfering bacteria in CAS medium were purple colonies,most of them can be differentiat— ed from Salmonella by recognizing carefully.Pseudomonas putida,Pseudomonas ∞ sce could be excluded by BS medium or biochemical tests,the selective effect of]TB and SC Broth on seven kinds of interfering bac— teria was different,suggested that,ITrB and SC Broth must be used together,then they will complement each other nicely to improve efficiency in detection. Key words:Salmonella;interference strain;chromogenic medium;isolation and identification 沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌,是食品 安全与质量检测的一个重要指标,世界各国普遍规定 1.2培养基及试剂 营养肉汤、四硫磺酸钠煌绿增菌液(1TrB)、亚硒酸 盐胱氨酸增菌液(sc)、亚硫酸铋琼脂(Bs)、木糖赖氨 酸脱氧胆盐琼脂(xLD)、HE琼脂(HE)、平板计数琼脂 (PCA)和三糖铁琼H ̄(TSI):北京陆桥技术有限责任公 司;沙门氏菌显色培养基(CAS):法国科玛嘉公司。 1.3方法 1.3.1培养基制备 食品中不得检出沙门氏菌【”,在GB 29921—2013((食品 安全国家标准食品中致病菌限量》标准中对沙门氏菌 的检出要求更为严格。在权威的沙门氏菌检测国标 中,将选择性增菌液接种鉴别培养基,分离可疑菌落 这一环节非常重要,首先要挑选特异性强的分离培养 基,减少干扰菌的影响,节约检测时间;其次还要挑选 灵敏度好的分离培养基,以防出现假阴性造成漏检; 试验所用培养基和试剂的制备均按照商品说明 书制备。 1.3.2菌株的复苏与接种 从9株菌株的保藏管中各挑取一环菌苔,分别划 线接种于PCA平板上,36℃过夜培养复苏菌株。将复 苏后的沙门氏菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、施氏 最后需要检验人员丰富的经验去挑选可疑菌落,避免 可疑菌落的后续生化鉴定试验中造成的人力物力的 浪费。 近年来大量的文献[2-5]报道了沙门氏菌显色培养 基(CAS)由于具有较高的敏感性和特异性,被实验室 广泛应用于沙门氏菌的快速检测中。该培养基利用培 养基中的细菌特异性酶的显色底物与沙门氏菌特有 的辛酯酶反应,从而通过观察菌落颜色就可直接对菌 落进行初步判定。但在实际检测过程中,往往还有一 假单胞菌、荧光假单胞菌、斯氏普罗威登斯菌、摩氏摩 根菌摩根亚种、粪产碱菌亚种8株菌株分别划线接种 于BS、XLD、HE、CAS平板,36℃培养18 h~24 h后观 些干扰菌在此培养基上出现与沙门氏菌属相似的菌 落,从而干扰检验人员的判断。文中将沙门氏菌与在 CAS培养基上分离得到的7株干扰菌做了分析比较, 察各菌落形态(其中Bs平板36℃培养40 h~48 h)。 1.3.3选择性增菌液对沙门氏菌和干扰菌株的增菌效 果测定 从而为沙门氏菌的分离鉴定提供借鉴。 1材料与方法 参照文献[6],将PCA平板上复苏的菌株接种到营 养肉汤中36 cC培养过夜,制备10倍系列稀释的菌悬 液,取10 一1O 稀释液各1 mL倾注平板各两块,36 cI= 培养18 h~24 h,作接种量计数,推算出10 ~10 稀释液 1 mL中所含的菌数。接种1 mL含菌量为1 000CFU~ 5 000 CFU的稀释液于10 mL TFB和SC增菌液中, 1.1菌株来源 铜绿假单胞菌CGMCC1.10274、大肠埃希菌 CGMCC1.4245和沙门氏菌CGMCC1.10603:中国普通 微生物菌种保藏管理中心;恶臭假单胞菌、施氏假单 胞菌、荧光假单胞菌、斯氏普罗威登斯菌、摩氏摩根菌 摩根亚种、粪产碱菌亚种为江苏泰州市食品药品检验 所实验室从样品中分离保存且经过梅里埃全自动细 菌鉴定仪VITEK 2 Compact鉴定的菌株。 1TrB增菌液置42℃培养箱中培养18 h~24 h,SC增菌 液置36℃培养箱中培养18 h~24h。取TYB、SC增菌液 各10 于平板中,每个增菌液做两平行,用PCA琼 脂倾注平板,36℃培养18 h~24 h,计算两个平行平板 的平均数。 王萍,等:显色培养基上沙门氏菌及干扰菌的分离鉴定 标准与检测 160 2结果 2.1沙门氏菌和干扰菌在不同培养基上的菌落形态 沙门氏菌和7株干扰菌在各分离培养基上的生长 和显色情况见表1。 表1沙门氏菌和7株干扰菌在不同培养基上的菌落形态 Table 1 The colony morphology of Salmonella strain and seven kinds of interfering bacteria in different media 在CAS显色平板上各菌株都呈类似的紫色菌落, 但从菌落形态看,铜绿假单胞菌菌落较小,易与沙门 氏菌菌落区分;施氏假单胞菌菌落有皱折;粪产碱菌 亚种菌落不规则;而斯氏普罗威登斯菌和摩氏摩根菌 摩根亚种在18 h观察时CAS显色平板上是乳白色和 灰白色菌落,随着时间延长至38 h,菌落转为淡紫色菌 落,由此说明控制好CAS显色平板的培养时间可以减 少一些干扰菌的产生。恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌 在CAS显色平板上的紫色菌落从形态和颜色上无法 与沙门氏菌区别,需通过进一步的生化试验才能区分。 XLD、HE平板上斯氏普罗威登斯菌为灰白色菌 落,其他6株干扰菌为粉红色菌落;BS平板上铜绿假 单胞菌为绿色菌落、斯氏普罗威登斯菌为灰绿色菌 落、摩氏摩根菌摩根亚种为浅绿色菌落,而其他4株干 扰菌都被抑制没有生长。 2.2沙门氏菌和干扰菌的生化试验情况 挑取PCA平板上培养18 h~24 h的新鲜培养物做 生化试验,结果见表2。 根据TSI琼脂和氧化酶试验,铜绿假单胞菌、恶臭 假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、粪产碱菌亚 种5株菌可直接判定为非沙门氏菌,斯氏普罗威登斯 表2沙门氏菌和7株干扰菌的生化试验结果 Table 2 Biochemical test results of Salmonella strain and seven kinds ofinterfering bacteria 注:表中一代表生化结果为阴性,+代表生化结果为阳性,玳表此生 化反应没有做。 菌、摩氏摩根菌摩根亚种虽然赖氨酸脱羧酶为阴性, 但还需要结合靛基质、pH7.2尿素、氰化钾生化试验才 能排除是甲型副伤寒沙门氏菌。 2.3 TFB和sc选择性增菌液对干扰菌的选择性情况 以沙门氏菌和大肠埃希氏杆菌为对照,检测了 1TrB和sc两种选择性增菌液对7种干扰菌株的增菌 效果,见表3。 表3 TTB和SC增菌液对7株干扰茵的选择性效果 Table 3 The seleetive effect of TTB and SC Broth on seven iknds of interfering bacteria 从表3可以看出,,rrB和SC对目标菌沙门氏菌 的增菌效果好,对非目标菌大肠埃希氏杆菌部分抑 制;7株干扰菌中,两种增菌液对铜绿假单胞菌和斯氏 普罗威登斯菌都有增菌作用,对荧光假单胞菌和粪产 碱菌亚种两株菌几乎是完全抑制,对于恶臭假单胞 菌、施氏假单胞菌这两种菌Sc增菌液的选择性强于 标准与检测 王萍,等:显色培养基上沙门氏茵及干扰菌的分离鉴定 WFB增菌液,对于摩氏摩根菌摩根亚种则是TTB选择 性强于SC。 3结论与讨论 沙门氏菌一般生化特性是利用葡萄糖产酸产气, 产H2S,不发酵乳糖和蔗糖;氧化酶阴性;赖氨酸脱羧 酶阳性。一些培养基(如XLD、HE、BS)就是根据这些 原理设计而成,但这些一般特征并不是沙门氏菌的独 有特征,同时还有一些个别的沙门氏菌没有这些特 征,如,奇异变形杆菌及柠檬酸杆菌等一些干扰菌在 XLD和HE培养基上的菌落形态和沙门氏菌相似,猪 霍乱沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌由于不产或延 迟产H2S在XLD和HE培养基上又会漏检,此外伤寒 沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌及一部分鸡白痢沙门氏菌 不产气,亚利桑那沙门氏菌和双相亚利桑那沙门氏菌 一部分菌株可以发酵乳糖,甲型副伤寒沙门氏菌的赖 氨酸脱羧酶为阴性,BS平板上一些肠杆菌与沙门氏菌 的形态特征很相似,难以分辨,检验者既不能把貌似 沙门氏菌的细菌当做沙门氏菌,也不能把沙门氏菌当 做非沙门氏菌,因此在分离检测沙门氏菌时培养基的 选择以及可疑菌落的挑选很重要。 XLD、HE平板上除了斯氏普罗威登斯菌以外,其 他6株干扰菌都与不产H2S的沙门氏菌菌落形态相 似;CAS平板上7株干扰菌都是紫色菌落,除了恶臭假 单胞菌和荧光假单胞菌外,其余菌株通过仔细辨认都 可与沙门氏菌区分,CAS培养时间控制在24 h以内可 以减少一些干扰菌的出现;BS平板上大部分菌都被抑 制不生长,包括CAS平板上无法从菌落形态区分的恶 臭假单胞菌和荧光假单胞菌,而其他生长的干扰菌也 是非典型菌落,由此可见Bs平板与CAS平板搭配使 用是筛选分离沙门氏菌的最好选择。 无法从菌落形态排除为非沙门氏菌的可疑菌落 应结合生化反应做判断,TSI琼脂和氧化酶试验可以 161-- 快速排除部分干扰菌菌株,对于一些易在CAS平板上 造成混淆的假单胞菌来说,氧化酶试验更是方便快 捷。赖氨酸脱羧酶、靛基质、pH7.2尿素、氰化钾是进一 步鉴定沙门氏菌的重要生化反应,由于微量生化系统 和全自动分析仪都只有赖氨酸脱羧酶一项,因此需要 实验人员额外补做试验。 食品样品基质多样复杂,增菌后除了少量的目标 污染菌,还会有大量的杂菌产生,因此要提高食品中 沙门氏菌的检出率,非选择性前增菌时要控制好8 h~ 18 h时间 ,尽可能地减少其他干扰菌的生长。选择性 增菌液,rI1B和sc的选择性强弱对7株干扰菌各不相 同,有的完全抑制,有的部分抑制,有的反而促进了干 扰菌的生长,因此在检测过程中,ITB和sc两种增菌 液须同时使用,才可以相互补充,提高检出率。 参考文献: [1]黄宝莹,佘之蕴,林耀文.四种方法检测食品中沙门氏菌的比较 [J]_食品工业科技,2014,35(15):185-192 [2】Pere JM,Cavalli P,Roure C,et a1.Comparison of four chromogenic media and hektoen agar for detection and presumptive identification of Salmonella strains in human Stools.【J].J Clin Microbiol,2003,41: 1130一l134 [3]刘振,于奂,肖强,等.一种有效检测沙门氏菌的显色培养基的研 究[J】.中国食品卫生杂志,2007,19(6):520—523 [4 卢勉飞,4]蔡芷荷,吴清平,等.显色培养基快速检测沙门氏菌效果 的研究fJJ.中国卫生检验杂志,2008,18(12):2618—2620 [5】王志伟.不同沙门氏菌及干扰菌的分离鉴定【J】.食品研究与开发, 2012,33(1):168-170 【6 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.6]GB4789.28—2013 食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要 求【s】.北京:中国标准出版社,2013:13—14 [7]中华人民共和国卫生部.GB4789.4—2010食品安全国家标准食 品微生物学检验沙门氏菌检验【s】.北京:中国标准出版社,2010: 4 收稿日期:2016—07—17