质粒DNA的提取（碱裂解法）

实验原理：

碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。 提取步骤：

1. 吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥

2. 加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率

3. 加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

4. 加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀

5. 4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中 6. 加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。 7. 等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中

8. 等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中

9. 加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。

10. 4℃下12000rpm离心5min，吸干上清液

11. 加70%乙醇1mL，颠倒数次，使质粒悬浮，12000rpm离心5min。

12. 吸干上清液，12000rpm离心1min，吸干乙醇。室温放置或超净工作台上风干质粒DNA约10min 13. 加20μL灭菌ddH2O或TE缓冲液充分溶解

14. 用紫外分光光度计检测其纯度和浓度后置于 -20℃保存备用。

注意事项：

1. 提取过程应尽量保持低温。提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提

2. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 可用异丙醇(一般使用等体积), 无水乙醇（2-2.5倍体积）

3. 6、7、8步骤是抽提蛋白的过程，根据实验要求，可以省略

4. 质粒DNA电泳会有三条带，最远的是线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂，线性分子；中间的是开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂，松弛的环状分子；共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂，超螺旋

相关溶液的参考配方: Solution I

50mmo1／L 葡萄糖

5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0) 1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0) Solution II

0.4mo1／L NaOH，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合

Solution III

5mo1／L 醋酸钾 60 mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL

相关溶液的作用

1、溶液I的作用 对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制 DNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。 2、溶液II的作用 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。 3、溶液III的作用 SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。2 M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂，小于100 kb的片断，就不容易与 PDS共沉淀。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。 4、酚/氯仿/异戊醇的作用 PDS的沉淀并不能将所有的蛋白质沉淀，酚可以使蛋白质变性，作用大于氯仿，但水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到

上层，不利于含质粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。还有，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。而用酚/氯仿混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。异戊醇的添加，主要可以使离心后上下层的界面更加清晰，方便水相的回收。